復合木霉菌制劑防治葡萄灰霉病的效果研究

王承芳，陳 娟，2，曠文豐，毛偉力*（. 上海萬力華生物科技有限公司，上海 20203；2. 上海交通大學，上海 200240）

復合木霉菌制劑防治葡萄灰霉病的效果研究

王承芳1，陳 娟1，2，曠文豐1，毛偉力1*
（1. 上海萬力華生物科技有限公司，上海 201203；2. 上海交通大學，上海 200240）

通過馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）進行平皿對峙培養，從11個木霉（Tricheoderma Spp.）菌株中篩選出5 株對葡萄灰霉菌（Botrytis cinerea，BC）有拮抗活性的菌株。以 Tr85為目標菌株，分別與另 4個木霉菌株進行相容性測試，將相容性好的 Tr85/Tr178B、Tr85/Tr469A 和 Tr178B/Tr469A 進行混合，制成含 2×108個/g 孢子的復合菌或單菌株可濕性粉劑（WP），用于室內生測。經Tr85/Tr178B WP處理的葡萄葉片，對BC的防治效果（ERDC）顯著高于（P≤0.05）其它復合菌株或單菌株WP處理。將Tr85/Tr178B WP繼續用于2012和2013年在上海和山東的大田藥效試驗。在上海，當Tr85/Tr178B WP施用量為3.0 kg/hm2、 3.75 kg/hm2和5.25 kg/hm2時，各處理間對BC的ERDC沒有顯著性差異，但它們都顯著高于（P≤0.05）2.25 kg/hm和化學農藥50%腐霉利WP3.75 kg/hm2處理。在山東，Tr85/Tr178B復合菌WP施用量在3.00 kg/hm2、 3.75 kg/hm2、5.25 kg/hm2的處理與50%腐霉利WP3.75 kg/hm2的處理之間，對BC的ERDC差異不顯著。但施用量為5.25 kg/hm2以及50%腐霉利WP3.75 kg/hm2（僅在2012年）對病害的ERDC顯著高于（P≤0.05）用量為2.25 kg/hm2。

木霉菌；抗藥性；灰霉病；防效

王承芳， 陳娟， 曠文豐， 等. 復合木霉菌制劑防治葡萄灰霉病的效果研究［J］. 生物災害科學， 2015， 38（4）:333-338.

葡萄灰霉病（Botrytis cinerea）是世界性分布、發生嚴重的葡萄病害之一。在低溫高濕的環境條件，特別當溫度為 20～23℃，空 氣相對濕度達 90%以上時發病嚴重［1］。隨 著保護地葡萄種植面積的不斷增大，灰霉病在保護地葡萄種植區域中的發生越來越嚴重［1］。目前，生產中對葡萄灰霉病的防治主要依靠化學農藥。然而，長期大量地使用化學農藥，促使了灰霉菌對許多化學農藥產生抗藥性，導致防治效果逐年下降［2-3］。 當前的研究調查表明，番茄灰霉菌對速克靈的抗藥性非常強，其中采自大豐番茄的 D1-3菌株對速克靈的抗性水平以達到EC50＞263.78 μg/mL，E C95＞6 000 μg/mL，其 中 EC95是敏感菌株的 1 400 倍［4］，同時化學藥劑的殘留，嚴重污染了農產品和生態環境，危及了人畜的健康。

近年來通過篩選和開發有益微生物及其代謝產物，使生物防治日益成為防控多種植物灰霉病的一條有效途徑［5-6］。但至今有關生防菌防治植物病害的研究多偏向于單一生防菌株對某個病害進行防治。在實際生產應用時，復合生防菌對環境的適應性、抗病范圍、防效穩定性等方面比單一菌株更有優勢，能夠提高對植物病害的防治效果［7-8］。陳永珍［9］利 用復合生防細菌解淀粉芽胞桿菌和熒光假單胞菌防治煙草灰霉病，對單個菌株和復合菌株進行藥效測試并發現，復合菌劑對灰霉病的防效顯著高于單一菌劑。譙天敏［10］利 用銅綠假單胞菌和長枝木霉對竹梢枯病進行防治，結果表明兩菌株分別對竹梢枯病有良好的防治作用，而將兩個菌株混合使用，協同防效大大提高。

本研究從生防木霉菌株的篩選入手，測試了木霉菌單菌株與復合菌株制劑在溫室和大田條件下，對葡萄灰霉病的防效差異性，為開發復合木霉菌制劑防治葡萄灰霉病，提供了可參考的數據和實踐方法。

1　材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 葡萄灰霉病原菌 灰葡萄孢霉（ Botrytis cinerea）菌株Bc-2，是由上海萬力華生物科技有限公司（上海萬力華）從 上海浦東地區葡萄種植園的病株上分離得到，經 分子和形態學鑒定為葡萄灰霉病的病原菌。

1.1.2 木霉菌株 本實驗中所測試的11個木霉菌株：T r85、T r115、T r178B、T r309、T r319B、T r407、T r422、Tr452B、Tr469A、Tr580、Tr606，均由上海萬力從全國不同地區的葡萄種植園中所采集的土壤和植株樣品，利用木霉菌選擇性培養基（TSM）分離得到的，所有菌株均保存在4 ℃的PDA培養基中備用。TSM培養基：TSM培養基配方（單位為g/L）：MgSO4?7H2O 0.2 g、KH2PO40.9 g、KCl 0.15 g、NH4NO31.0 g、葡萄糖3 g、氯霉素0.25 g、甲基磺0.3 g、五氯硝基苯0.2 g，玫瑰紅0.15 g、瓊脂20 g。

1.1.3 供試藥劑 50%腐霉利可濕性粉劑：由日本住友化學株式會社生產。

木霉菌可濕性粉劑（WP）：將篩選出的菌株，經過發酵和劑型處理，制成含2×108/ g活孢子的木霉菌WP。

1.2 方 法

1.2.1 木霉菌對病原菌的平皿拮抗測試 采用兩點對峙培養法，在直徑為90 mm的 PDA平皿上，一側接種直徑為 5 mm Bc-2 的病原菌絲塊，另一側分別接種直徑為 5 mm的 1 個木霉菌株的菌絲塊，單獨接種病原的平皿為對照，每個處理有3 個重復。將接種的平皿放置在 25 ℃恒溫箱中培養 4 d后，分別記錄每個處理的病原菌菌落生長直徑，取平均值，并根據以下公式計算抑菌率：

1.2.2 木霉菌株相容性測試 在PDA培養基平皿中心接種1株直徑為5 mm的目標木霉菌株的絲塊，同時在其四周分別接種另四株直徑為5 mm的木霉菌株的菌絲塊，每個處理重復3次。將平皿放置在28 ℃的培養箱中培養3 d后，觀察和記錄目標木霉菌株與其它木霉菌株之間的相容性反應。2個菌株生長之間不產生抑菌條帶（抑菌圈）的為相容性好，反之為不相容。

1.2.3 復合木霉菌制劑抑制葡萄灰霉病室內生測和大田藥效測試 （1）室 內離體生測實驗。采 葉齡一致、帶有1～2 cm葉柄的葡萄葉片，用濕棉球包裹葉柄保濕并放置在培養皿中。將含2×108/g活孢子的木霉菌可濕性粉劑（WP），用無菌蒸餾水（SDW）進行梯度稀釋至cfu為1×105的單菌株懸浮液，再將兩個單菌株懸浮液按1∶1體積進行混合，配置成雙菌株復合懸浮液。將各處理藥液以及SDW（病原對照處理）均勻地噴灑到葉片正反面，每個處理10個葉片，重復4次。待藥液干后，用無菌接種器取直徑為5 mm的Bc-2病原菌絲塊，接 種到各處理葉片的背面，將 葉背面朝上置于培養皿內，蓋 上皿蓋。將 培養皿置于設置為：溫度25 ℃，濕度85%，12 h光暗交替，光強為10 000 Lux條件下人工氣候箱中培養5 d后，觀察和記錄個處理葉片的病斑直徑，取平均值。

（2）大 田藥效實驗。大 田藥效測試點安排在上海市浦東新區傅嘉果蔬專業合作社和山東省泰安市岱岳區天平辦事處南王家莊葡萄園，測試時間在2012和2013年。測試處理包括用2×108個/g復合木霉菌WP（Tr85/Tr178B）的處理1（Trt.1）: 2.25 kg/hm2；Trt.2: 3.00 kg/hm2；Trt.3:3.75 kg/hm2以 及Trt.4:50%腐霉利WP3.75 kg/hm2和Trt.5:清水對照（CK）。每個處理小區面積為30 m2，重復3次，采用隨機區組排列。噴藥處理共3次：1：葡萄花絮分離期；2：初花期；3：末花期。每畝用水量為50 L。在第1次施藥前和第3次施藥后7～10 d進行統計。調查每小區的全部花穗數，病情指數是以每個花穗的發病面積占整個花穗的百分比進行分級，0級：花序無病；1級：花序發病＜5%；3級：6～10%；5級：11～25%；7級：25～50%；9級：＞50%。病情指數和防治效果按以下公式進行計算。

2　結果與分析

2.1 平皿拮抗培養測試

通過將 11 個木霉株與病原菌株 Bc-2 進行對峙培養測試，4 d后觀察到，不同的木霉菌株對 Bc-2 生長的抑制率差異較大（見表 1）。雖然所有測試的木霉菌株對 Bc-2 生長的抑制率都超過了 50%，但只有Tr178B，Tr469A和 Tr85 對 Bc-2 生長的抑制率超過了 75%，分別為 75.00%，77.78%和 83.33%，顯著地高于（P≤0.05）其它菌株對 Bc-2 生長的抑制率。

表1　木霉菌株與BC-2平皿拮抗培養測試結果

2.2 木霉菌株相容性測試

通過以上平皿拮抗培養測試，選出 5 個對 Bc-2 生長抑制率強的木霉菌株 Tr422，Tr178B，Tr452B，Tr469A和 Tr85，并以 Tr85 作為目標菌株，測試 Tr85與其它 4 個菌株之間的相容性。結果顯示（見表 2和圖 1），Tr85 分別與 Tr469A和 Tr178B 菌株之間，以及 Tr469A和 Tr178B 之間相容性好，但與 Tr422 和 Tr452B 之間不相容。

表2　木霉菌株相容性測試結果

2.3 室內離體生測實驗

根據木霉菌株相容性測試結果，選用了 Tr178B，Tr469A，Tr85單菌株和雙菌株 WP 懸浮液進行室內離體生測試驗。結果顯示（見表3）， 經單菌株和雙菌株WP 懸浮液處理的葡萄葉的灰霉病病情指數都控制在 25 以下，顯著低于（P≤0.05）經 SDW CK處理葉片的病情指數， 防治效果 （ERDC， %） 都達到 55%以上。 其中， 經單菌株 Tr85 WP處理的葉片，對葡萄灰霉病的 ERDC為 66.42%，顯著性地高于（P≤0.05）經其它單菌株 WP 和 Tr178B/Tr469A 以及 Tr85/Tr469A 雙菌株WP 處理葉片的 ERDC，但顯著低于（P≤0.05）經 Tr178B/Tr85 雙菌株 WP 處理葉片的 ERDC（74.04%）。

圖1　木霉菌株Tr85與其它4株菌株間相容性測試

表3　復合木霉菌株WP防治葡萄灰霉病室內生測實驗結果

2.4 田間藥效測試

將Tr85/Tr178B復合WP進一步用于防治葡萄灰霉病的田間藥效試驗，結果顯示（見表3），雖然2012年兩個試驗點的病情指數（DS）都高于 2013 年，同時在對葡萄灰霉病的 ERDC 上，不同地區有一定的差異性，但 在同一地區，兩 年的ERDC基本一致。在 上海，當 Tr85/Tr178B復合菌WP施用量為3.00 kg/hm2、3.75 kg/hm2和5.25 kg/hm2時，每個處理間對灰霉病的ERDC沒有顯著性差異，但它們都顯著性地高于行改革（P≤0.05）用量為2.25 kg/hm2和化學農藥50%腐霉利WP3.75 kg/hm2對灰霉病的ERDC。在山東地區，Tr85/Tr178B復合菌WP施用量在3.00 kg/hm2、 3 .75 kg/hm2、5 .25 kg/hm2的處理與50%腐霉利WP3.75 kg/hm2的處理之間，對灰霉病的 ERDC差異不顯著。但施用量為 5.25 kg/hm2以及 50%腐霉利WP 3.75 kg/hm2（僅在 2012年）對灰霉病的ERDC 顯著性地高于（P≤0.05）用量為2.25 kg/hm2。

表4　2億活性孢子/克木霉菌WP防治葡萄灰霉病的效果

3　結論與討論

對于大多數植物的病原菌生防菌的篩選，大部分是利用平皿對峙法進行菌株的篩選，但是單純依靠一種方法來篩選某一種植物病害的生防菌是不太可靠的，且容易造成漏篩。據陳捷［11］介紹篩選木霉菌的作用機理多樣，熊敏［12］利 用 11 株不同木霉菌株分別比較對峙培養法、病原菌存活率測定法、生防菌分泌物降解病原菌測定法、浸種抑菌萌發試驗法及種苗接種活體篩選法對抑制黃瓜枯萎病尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的拮抗木霉菌的篩選效率。試驗表明不同的篩選方法獲得拮抗木霉菌菌株的結果差異較大。本 文通過平皿拮抗培養測試和室內離體生測試驗兩種室內篩選方式相結合，篩 選出 Tr85/Tr178B復合菌株。將 其制成含 2×108個/g活孢子的木霉菌WP，在 田間 2 年 4地的藥效測試中，試 驗效果穩定。因此，利用多種室內篩選方法有利于篩選出效果穩定的菌株。

在進行生防菌復合前，要對菌株之間的親和性進行測試，因為菌株之間的親和與否對植物病害的防治效果有一定的影響。如菌株之間親和性好，通常有協同增效作用，如菌株之間親和性不好，容易引起藥效不穩定。陳志誼［13］研 究了拮抗細菌菌株之間親和性和生物防治效果之間的關系。本文試驗表明:在兩個拮抗菌之間存在多種互作關系。當混合的 2 個菌株之間互作關系是親和的，其生防效果有所提高。如Tr85 和 Tr178B，單獨菌株的防效分別為 66.42%和 55.71%，而復合后達到 74.04%，提高了 7.62%。當復合的 2 個菌株之間互作關系是不親和的，有 的菌株組合生防效果提高不明顯甚至下降。如 Tr85 和 Tr469A單獨菌株的防效分別為 66.42%和 59.62%，而復合后達到 67.48%，僅提高了 1.06%。因此，在生物防治的實際應用中，對不同的菌株進行親和性測試，篩選出具有協同、增效作用的親和性好的菌株，為生防菌組合菌劑具有較好的防治效果和生態適應性。

生物防治的防治效益和穩定性始終是限制生物防治發展的主要問題。由于單一生防菌株適應性有一定限制，使用復合菌則可拓寬木霉菌的適應范圍，有利于抵抗葉表不良的環境條件，同時強化生防效應［8］。因為混合使用時菌株間的作用可能不只是簡單的積加而具有了一定的協同性，提 高了與病菌的競爭能力。如 Tr85 和 Tr178B 分別為哈茨木霉和綠色木霉，兩者的復合菌株的防治效果比其它組處理效果好。因此通過不同類型生防菌復合使用可以在一定程度上解決生防菌適應性差和防效偏低的問題。

灰霉病發生的嚴重程度受當年的天氣影響比較大［1］。從文中比較 2012 和 2013 年，這兩年的天氣差異顯著，導致病害整體發生區別較明顯。2012 年陰雨天氣多，空氣濕度大，上海和山東兩地的灰霉病的病情指數均較 2013 年高。因此，在預測到葡萄開花時期陰雨天氣多時，應提前防治，以免灰霉病大規模爆發。

總之，目前木霉菌防治灰霉病的運用主要在試驗室，在田間的具體應用較少。作者通過對木霉菌可濕性粉劑的田間藥效研究，表明了在實際應用過程中利用混合木霉菌對葡萄灰霉病進行防治，取得優異的防治效果。使用 2.25 kg/hm2的使用劑量，能夠保證其效果穩定。

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Bio-control of Grape Grey Mold by Using A WP-Formulation Mixed with Two Trichoderma Strains

WANG Cheng-fang1， CHEN Juan1，2， KUANG Wen-feng1， MAO Wei-li1*
（1. Shanghai WLH Bio-tech Corpration， Shanghai 201203， China； 2. Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240， China）

A screening test was conducted on petri dishes with potato dextrose agar （PDA）， and five Trichoderma strains were selected from 11 strains， which showed an antagonistic effect on inhibiting the growth of the pathogen of grape grey mold （Botrytis cinerea）. Using Tr85 as a target strain，a compatibility test was conducted with the other 4 strains. A wettable powder （WP） formulation containing 2x108/g spores was made with each of the signal strains or 2 strains， which were then used in an indoor bioassay. The grape leaves treated with the WP formulated with 2 strains of Tr85/Tr178B had a significantly higher（P≤0.05）efficacy rate （%） of disease control（ERDC） compared to those treated with each of the WPs formulated with a signal strain or other 2 strains. The WP formulation with Tr85/Tr178B was further used in field tests located in Shanghai and Shandong in 2012 and 2013. In Shanghai， there were no significant differences on ERDC among the treatments with the WP formulations of Tr85/Tr178B at 2.25 kg/hm2、 3.00 kg/hm2、5.25 kg/hm2， but the parameters of ERDC of each of the treatments were significantly higher（P≤0.05）than those with the treatments ofTr85/Tr178B WP at 2.25 kg/hm2and the chemical fungicide of 50% Procymidone WP at 3.75 kg/hm2. In Shandong， there were no significant differences on ERDC among the treatments of the WP formulations with Tr85/Tr178B at 2.25 kg/hm2、 3.00 kg/hm2、 5.25 kg/hm2a nd 50% Procymidone WP at 3.75 kg/hm2， but the parameters of ERDC with the treatments of Tr85/Tr178B WP at 5.25 kg/hm2and 50% Procymidone WP at 3.75 kg/hm2（only in 2012） were significantly higher（P≤0.05）than those with the treatment of Tr85/Tr178B WP at 2.25 kg/hm2.

Trichoderma； drug resistance； grape grey mold； mixed strains； efficacy rate of disease control

S436.631

A

2095-3704（2015）04-0333-06

2015-10-13

科技型中小企業技術創新基金（14C26213100929）、浦東新區科技發展基金創新資金（PKJ2014-NO1）和上海市科技型中小企業技術創新資金（1408H138600）

王承芳，女，工程師，碩士，主要從事生物農藥研發，E-mail: wangfang3307@163.com；*通信作者：毛偉力，博士，E-mail:weilimao@hotmail.com。