高效石油烴降解菌CQ6的分離鑒定及He—Ne激光誘變

付瑞敏 康治華 彭瑞強 陳五嶺

摘要：從長慶油田石油污染土壤中分離得到一株產生生物表面活性劑的高效石油烴降解菌。通過形態學、生理生化和分子生物學研究，篩選出的菌株CQ6被鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。為了增強該菌降解石油烴的能力，對其進行He-Ne激光誘變，獲得6株突變株，通過檢測其表面張力、排油圈直徑和烴降解率，降解石油烴能力最強且遺傳性狀穩定的突變株CQ66被挑選出來。本研究表明，He-Ne激光誘變育種技術可有效改良石油烴降解菌，該手段對修復石油污染土壤具有現實意義。

關鍵詞：石油烴降解菌；表面活性劑；He-Ne激光誘變；遺傳穩定性

中圖分類號： S182 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0404-03

隨著石油工業的快速發展，在石油勘探、開采、運輸及煉制等過程都會出現原油的泄漏，從而對土地和鄰近水體造成嚴重污染[1]。這些原油可通過生物學或非生物學途徑而逐步降解。研究表明，消除石油烴污染的各個因素中，微生物降解具有重要作用，當前已報道有多種微生物具有降解石油烴并產生表面活性劑的能力[2-4]。李倩等制備石油烴降解菌劑并將其應用于溢油岸灘的生物修復，結果發現經過28 d的生物修復，其石油烴降解率最高達45.07%[5]?？梢姴捎矛F代育種技術選育石油烴降解菌對于石油污染區域的生物修復具有極為重要的應用價值。 激光可通過光、電、熱和電磁等綜合作用引起菌體細胞基因發生改變，從而使所產生的酶發生激活或鈍化[6]。低能量的He-Ne激光作用于菌體細胞，可促進菌體細胞生長進而提高代謝物產量，當前引起了微生物育種者的廣泛關注[7]。本研究針對長慶油田石油污染土壤，進行了石油烴高效降解菌的分離、鑒定，并通過He-Ne激光輻射誘變育種，選育出一株遺傳性能穩定的高效石油烴降解菌，以期為石油污染土壤的生物修復提供數據參考。

1 試驗材料

1.1 菌種來源

從長慶油田石油污染土壤中提取。

1.2 培養基

1.2.1 無機鹽培養基 MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO4 1.0 g，KH2PO4 1.0 g，NH4NO3 1.0 g，FeCl3 0.05 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

1.2.2 選擇培養基 將2 g原油抽濾滅菌后加到上述無機鹽培養基中，即為液體選擇培養基，也叫原油發酵培養基。在培養基中加入15 g瓊脂制成相應的固體選擇培養基，即為油平板。試驗所用原油采自長慶油田G010-18 井。

1.2.3 LB培養基 蛋白胨8 g，氯化鈉7 g，酵母浸膏5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，即為液體培養基；固體培養基的瓊脂添加量控制在15%～18%。

1.2.4 復壯培養基 蛋白胨8 g，氯化鈉7 g，酵母浸膏5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，葡萄糖50 mmol/L

1.3 試驗儀器

He-Ne激光發生器（波長632 nm，功率10 mW），由西北大學光電廠生產；WZY-1自動液體表面張力儀，由上海衡平制造廠生產。

2 試驗方法

2.1 菌株培養

菌株分離自長慶油田G010-18 井周邊污染土壤。將100 mL選擇液體培養基加入到250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min，而后稱取5 g污染土壤置于其中，透氣封口膜封住瓶口，280 r/min、30 ℃搖床振蕩培養7 d。

2.2 菌株篩選與分離

2.2.1 初篩 采用梯度稀釋法，將培養后的菌液用無菌水連續稀釋101～107倍，取10-5、10-6、10-7的梯度稀釋液分別涂布于以石油烴為唯一碳源的油平板上，每個稀釋度均做3個平行試驗，將其置于37 ℃培養3 d，能在油平板上生長的就是石油烴降解菌。將石油烴降解菌通過平板劃線獲得單菌落，將其轉至斜面，4 ℃保存。

2.2.2 復篩 為了進一步檢測石油烴降解菌對石油烴的降解能力，采用表面張力檢測、排油圈[8]和烴降解率[9]等3種方法進行復篩。（1）表面張力檢測[8]。將篩選出的石油烴降解菌菌株活化，以2%的比例接入葡萄糖發酵培養基，280 r/min、30 ℃搖床振蕩培養7 d后，使用張力儀檢測發酵液的表面張力。（2）排油圈[8]。取90 mm培養皿，加入 50 mL 去離子水，滴加0.1 mL液體石蠟于水面，石蠟中心加入10 μL發酵液，發酵液會將石蠟擠向四周形成圓圈，菌株所產生表面活性劑的量及活性同該圓圈的直徑成正比。通過對比各菌株所形成的排油圈，選取排油圈直徑最大的菌株作深入研究。上述試驗均重復3次。（3）烴降解率[9]。將石油烴降解菌菌液以10%的比例接入50 mL的原油發酵培養基中，280 r/min、30 ℃搖床振蕩培養7 d后，按照文獻[9]中方法測定培養液中原油降解率，計算石油烴降解率。

降解率（D）=（m1-m7）/m1×100%。

式中：m1為初始發酵培養基中原油含量；m7為培養7 d殘留油含量。

經過上述試驗，即可選出降解石油烴能力最強的菌株。

2.3 形態學和生理生化鑒定

參照文獻[10-11]對所選的降解石油烴能力最強的菌株進行形態學鑒定（包括革蘭氏染色、芽孢染色和大小測定等），并參照微生物試驗標準對該菌進行生理生化測定（包括過氧化氫酶反應、糖發酵試驗、IMViC試驗、淀粉水解試驗、檸檬酸鹽利用試驗、酪素水解試驗和耐鹽性試驗等），上述試驗均重復3次。

2.4 16S rDNA序列分析

參照Fani等的方法[12]，采用上海生工生物工程技術服務有限公司提供的試劑盒提取所選菌株的DNA和回收其16S rDNA片段。16S rDNA 的PCR擴增引物采用通用引物（27F：5′-AGAGTTGTCATGGCTC-3′和1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′），該引物合成自上海生工。PCR反應參數：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 90 s，共計30個循環；72 ℃ 10 min。將所得PCR產物回收純化并提交目的片段至上海生工進行基因測序，所得序列采用MEGA 3.0同NCBI上的相近物種的16S rDNA序列構建系統發育樹，樹的聚類穩定性進行1 000次自導檢驗[13]。

2.5 He-Ne激光誘變和突變株的選育

2.5.1 誘變前的活化

將所選菌株于37 ℃培養24 h后，用5 mL無菌生理鹽水沖洗斜面后將其置于三角瓶中（內含玻璃珠），充分振蕩混勻，采用光電比濁計數法將菌懸液的D值調節至0.986，使其濃度為108 CFU/mL。

2.5.2 He-Ne激光誘變[14]

取2 mL菌懸液分別置于無菌試管中，將 He-Ne 激光的輸出功率調節為10 mW，照射距離調節為 25 cm，照射時間為5、10、15、20、25 min，以原菌液為對照，試驗均重復3次。

2.5.3 誘變菌培養

無菌條件下取1 mL激光照射后的菌液，將其置于裝有9 mL無菌水的試管中，作為10-1，振蕩混勻后再以同樣方法將其稀釋至10-5、10-6、10-7，從3個梯度的稀釋液中各取0.2 mL涂平板，每個稀釋度設3個平行，37 ℃ 培養20 h后，以原菌懸液作為對照，進行菌落形態觀察和菌落計數。

2.5.4 存活率和正突變率的計算

將激光誘變后的菌懸液用復壯培養基培養，條件為280 r/min 、37 ℃下培養6 h，而后使用梯度稀釋法將其稀釋至10-6，分別取0.1 mL 10-4、10-5和10-6的稀釋液涂布在油平板上，以未照射的菌液為對照，37 ℃、96 h后觀察生長狀況，并計算存活率和正突變率：

存活率=誘變后活菌數/誘變前活菌數×100%；

正突變率=正突變菌株數/誘變后活菌數×100%。

2.5.5 挑取優良突變株

通過菌落形態觀察和計數，從誘變后的菌株中挑選出菌落形態變化較大、長得又快又好且透明圈明顯的突變株，通過表面張力檢測、排油圈和烴降解率等方法檢測正突變株降解石油烴和產生表面活性劑的能力，并挑選優良突變株。

2.5.6 突變株遺傳穩定性試驗

將挑選出的降解石油烴能力最強的突變株轉接至LB平板上，作為第1代，然后以相同方法連續繼代20代，每隔4代分別將其按照10%的比例接入原油發酵培養基中，280 r/min、30 ℃搖床振蕩培養7 d，測其降解率和表面張力，并將其與第1代菌株比較，確定突變株的遺傳穩定性。

3 結果與分析

3.1 石油烴降解菌的篩選與分離

從長慶油田石油污染土壤中分離得到可在油平板上生長且產生透明圈的石油烴降解菌6株，分別為CQ1、CQ2、CQ3、CQ4、CQ5和CQ6，經過表面張力、排油圈和烴降解率等方法檢測，結果如表1所示：6株菌對石油烴的降解能力和產生表面活性劑的能力有較為顯著的差異，菌株CQ6的排油圈直徑和石油烴降解率均高于其他菌株，且表面張力低于其他菌株?；诖耍f明菌株CQ6的降解石油烴能力和產生表面活性劑能力最強，因此選取菌株CQ6進行后續研究。

3.2 石油烴降解菌CQ6的表型特征和生理生化特性

將上述所選的石油烴高效降解菌株CQ6挑選出來并進行顯微鏡鏡檢和菌落形態觀察。結果顯示：該菌個體形態為桿狀，G-，產橢圓形芽孢，芽孢囊膨大，菌落干燥、不透明且有皺褶，菌落邊緣有不規則擴散。

對CQ6進行生理生化檢測，結果顯示：CQ6為嚴格好氧菌，抗氯化鈉2%、5%、7%、10%，可發酵葡萄糖產酸，IMViC試驗結果為-+++，淀粉水解和酪素水解試驗結果為陽性。

通過分析CQ6的表型特征和生理生化特征，發現其形態和生理生化特點均和枯草芽孢桿菌標準株相同，據此，可初步判定菌株CQ6為芽孢桿菌屬。

3.3 CQ6的16S rDNA的系統發育研究

菌株CQ6的16S rDNA片段（約1 500 bp）的PCR擴增結果如圖1所示，將所得PCR產物測序，得到 1 492 bp 的序列，將該序列和NCBI數據庫中的各近緣菌株的16S rDNA序列進行比對，應用Bioedit7.0軟件進行多重比較，分析其同源性，并構建系統發育樹（圖2），經分析，所得序列和Bacillus pumilus（登錄號：X60637）顯示了99%的同源性，根據其系統進化特征，可確定菌株CQ6為短小芽孢桿菌。

3.4 突變株篩選

用激光照射誘變育種的生物學效應主要是引起基因突變從而使酶激活或鈍化，激光照射時間會導致突變率發生變化，照射時間越長，突變率越高，但是致死率也隨之升高，因此要挑選合適的照射時間以保證一定的突變率和控制致死率。用激光對石油烴降解菌CQ6照射不同時間，結果如表2所示。

由表2可以看出，隨著照射時間的延長，菌株的存活率不斷下降，正突變率的變化趨勢是先升高后降低，推斷造成這種情況的原因是由于照射時間過長，不僅會導致活菌數劇烈下

降，也會使更多的菌株出現負突變，因此，綜合考慮，CQ6的最佳照射時間選為15 min。

采用排油圈檢測、表面張力檢測和烴降解率等方法，5株降解石油烴和產生表面活性劑的能力均強于親本CQ6的菌株被挑選出來，分別編號為CQ61、CQ63、CQ65、CQ66和CQ67，其降解石油烴和產生表面活性劑的結果如表3所示。

如表3所示，突變株CQ66的排油圈直徑和石油烴降解率均高于其他突變株，且表面張力低于其他突變株，說明該突變株的降解石油烴能力和產生表面活性劑能力是突變株中最強的，故將其挑選出來，用于后續研究。

3.5 突變株遺傳穩定性研究

把石油烴降解能力和產生表面活性劑能力均有所提高的突變株CQ66繼代培養20代，每隔4代的菌株分別做石油烴降解率和表面張力試驗，結果（表4）表明各代降解石油烴和產生表面活性劑的能力基本一致，說明突變株CQ66的降解石油烴能力的遺傳穩定性良好。

4 討論

本研究從長慶油田石油污染的土壤中分離篩選得到一株高效降解石油烴和產生表面活性劑的菌株CQ6，經形態學、生理生化和分子鑒定確定該菌株為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。

為了增強該菌株降解石油烴的能力和產生表面活性劑的能力，對所選菌株進行He-Ne激光誘變育種，并確定最佳照射時間為15 min。

He-Ne激光誘變后，采用排油圈檢測、表面張力檢測和烴降解率等方法挑選出降解石油烴和產生表面活性劑能力最強的突變株CQ66，并對其進行遺傳穩定性檢測， 試驗結果表明，該突變株降解石油烴和產生表面活性劑的遺傳性狀穩定，可用于制備固體菌劑或液體菌劑應用于長慶油田石油污染土壤的生物修復。

參考文獻：

[1]Ueno A，Ito Y，Yumoto I，et al. Isolation and characterization of bacteria from soil contaminated with diesel oil and the possible use of these in autochthonous bioaugmentation[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2007，23（12）：1739-1745.

[2]Sathishkumar M，Binupfiya A R，Ho B S，et al. Biodegradation of crude oil by individual bacterial straias and a mixed bacterial consoainm isolated from hydrocarbon contaminated areas[J]. Clean，2008，36（1）：92-96.

[3]姜 肸，高 偉，李 倩，等.南海高效石油降解菌的篩選及降解特性研究[J].環境科學學報，2012，32（7）：1572-1578.

[4]王彥杰，畢思寧，左豫虎，等.一株表面活性劑產生菌的分離及抑菌活性[J].微生物學通報，2012，39（3）：353-360.

[5]李 倩，高 偉，崔志松，等. 不同劑型石油降解菌劑在模擬溢油岸灘修復中的中試應用[J]. 海洋環境科學，2013，32（5）：772-775.

[6]陳義光，李銘剛，徐麗華，等.新型物理誘變方法及其在微生物誘變育種中的應用展[J].長江大學學報：自然版，2005，2（5）：46-50.

[7]馬昕源. 微生物激光誘變育種應用研究進展[J].河北農業科學，2008，12（1）：75-77.

[8]劉 佳，黃翔峰，陸麗君，等.生物破乳劑產生菌的篩選及其方法研究[J].微生物學通報，2008，35（5）：690-695.

[9]崔麗虹，郭 萍，李寶明，等. 石油烴降解菌的篩選與鑒定[J]. 生物技術通報，2009（9）：143-147.

[10]布坎南R E，吉本斯N E.伯杰細菌鑒定手冊[M].8版.北京：科學出版社，1984：729-795.

[11]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001：43-66.

[12]Fani R，Bandi C，Bazzicalupo M，et al. Phylogeny of the genus Azospirillum based on 16S rDNA sequence[J]. FEMS Microbiology Letters，1995，129（2/3）：195-200.

[13]Han J，Sun L，Dong X，et al. Characterization of a novel plant growth-promoting bacteria strain Delftia tsuruhatensis HR4 both as a diazotroph and a potential biocontrol agent against various plant pathogens[J]. Systematic and Applied Microbiology，2005，28（1）：66-76.

[14]付瑞敏，韓鴻鵬，張麗琴，等.葡萄霜霉病和白粉病拮抗菌的分離、鑒定和He-Ne激光誘變[J].江蘇農業科學，2013，41（8）：122-125.