峨眉山異葉天南星抗MRSA內生細菌的篩選

唐梅 龔明福 管芩瀾 羅燕

摘要：從峨眉山采集異葉天南星（Arisema heterophyllum Blume）健康植株，采用平板涂布法從其根、莖、葉各組織分離純化內生細菌，采用菌餅平板對峙培養法初步篩選抗甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的菌株，采用牛津杯法進一步篩選抗性菌株。結果表明，可以從峨眉山異葉天南星根、莖、葉各組織中分離得到26株內生細菌；初篩結果顯示，26株內生細菌對MRSA均有抗菌活性，其中平均抑菌圈直徑超過12 mm的有12株；復篩結果顯示，12株拮抗菌抗MRSA活性穩定，與初篩結果無明顯差異，菌株YG009、YJ009抗MRSA活性最強，與其他菌株存在極顯著差異，有開發抗MRSA新藥的潛力。

關鍵詞：異葉天南星；內生細菌；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；峨眉山；篩選

中圖分類號： S567.23+9.01 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0388-02

異葉天南星（Arisema heterophyllum Blume）為天南星科天南星屬多年生草本植物，全國各地均有分布，主要以塊莖入藥[1]。相關研究結果表明，天南星科藥用植物在毒性、刺激性、藥用成分、藥理活性等很多方面的相似性可以達到80%以上[2]，因此異葉天南星具有與天南星科藥用植物相似的功效，且對驚厥等疾病有較好治療作用[3]。植物的內生菌（endophyte）是指在一定或全部階段生活在健康植物組織內部的微生物，普遍存在于高等植物中。內生菌由于長期生活在植物組織內部而與植物和諧生長，能夠產生與宿主植物所產生的相同或相似的活性化合物[4]。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是臨床上常見的1種毒性比較強的細菌[5]，是金黃色葡萄球菌的1種，但能夠耐甲氧西林，可引起多種化膿性疾病。MRSA除了對甲氧西林有耐藥性外，還對臨床上應用的多種抗生素具有耐藥性，所導致的感染呈暴發性或散發性流行，治療極其困難，致死率極高，成為全世界范圍內抗感染的難題[6]。從藥用植物中篩選出抗MRSA的內生細菌，對于預防和控制由MRSA引起的感染具有重要意義[7]。本研究從采自峨眉山的異葉天南星的根、莖、葉組織中分離內生細菌，采用牛津杯法測定內生細菌對MRSA的抑菌活性，從中篩選抗MRSA活性強的菌株，為抗MRSA新藥篩選及峨眉山異葉天南星的保護及開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年8月5日從峨眉山萬年寺（海拔約800 m）附近采集健康的異葉天南星植株，采集后立即保存于袋內，并迅速帶回實驗室進行內生細菌的分離。MRSA由峨眉山特色生物資源重點實驗室提供。

1.2 內生細菌的分離

分別取健康異葉天南星的根、莖、葉5～10 g，用自來水沖洗表面的泥土等污物后用無菌水沖洗3～5次，再分別用有效氯含量為5%的次氯酸鈉消毒2 min、75%乙醇消毒 1 min、01%HgCl消毒5 min，再用無菌水沖洗3～5次后放入無菌攪拌機中打漿，粉碎的組織液置于無菌的三角瓶中備用。分別取最后1次沖洗液和粉碎的組織液各1 mL，稀釋10 000倍，涂布于NA平板培養基（蛋白胨0.3%、牛肉膏05%、NaC1 0.5%、葡萄糖0.5%、瓊脂1.8%～2.0%、pH值7.0）上，于 28 ℃ 下培養，逐日觀察。將挑取的單菌落劃線純化后接種至斜面培養基，28 ℃培養5～7 d，之后于4 ℃保藏菌種。

1.3 異葉天南星拮抗性內生細菌初篩

在NA平板上涂布接種100 μL MRSA培養液，將異葉天南星內生細菌的菌餅（直徑7 ㎜）有菌面平整貼在平板表面，28 ℃培養2～3 d后用十字交叉法測量抑菌圈直徑，即通過2次十字方位來測量同一抑菌圈的直徑，然后再將測得的2次數據求平均值，即為該內生細菌抑菌圈的直徑。以無菌的培養基餅（直徑7 mm）代替內生細菌接種作為對照，每個處理重復3次。

1.4 異葉天南星拮抗性內生細菌復篩

為了獲得抑菌能力較穩定、較強的菌株，將初篩獲得的活性菌株純培養后制成菌懸液。在NA培養基上涂布接種 100 μL MRSA培養液，涂布均勻，每個平板中等距離均勻插入3個牛津杯（直徑7 mm），每個牛津杯接種同種活性菌株菌懸液100 μL。28 ℃培養2～3 d后用十字交叉法測量抑菌圈直徑。在牛津杯中注入100 μL無菌水代替活性菌株菌懸液接種作為對照，每個處理重復3次。

2 結果與分析

2.1 異葉天南星內生細菌的分離純化

采用組織液涂布分離方法從異葉天南星健康植株的根、莖、葉中共分離純化得到26株內生細菌。其中從根中分離出9種菌株，編號依次為YG001-YG009；從莖中分離出11種菌株，編號依次為YJ001-YJ011；從葉中分離出6種菌株，編號依次為YY001-YY006。

2.2 抗MRSA內生細菌初篩結果

將分離純化得到的26株異葉天南星的內生細菌制成菌餅，然后采用平板對峙法測定內生細菌對MRSA的抑菌活性。結果表明，26株內生細菌對MRSA均有抑菌活性，但各菌株間抑菌活性存在較大差異（表1），其中平均抑菌圈直徑超過12 mm的菌株有12種，分別為YG009、YJ009、YJ004、YJ002、YJ006、YJ003、YG001、YG008、YJ011、YJ007、YY003、YY001，選取這12株內生細菌進行復篩。

2.3 抗MRSA內生細菌復篩結果

對初篩中抑菌直徑超過12 mm的12株菌株采用牛津杯法復篩，結果表明，12株菌株對MRSA均具有較高的抑菌活性（表2）。其中YG009、YJ009對MRSA的抑菌活性最強，與其他菌株差異極顯著。各菌株抑菌活性與初篩結果無明顯差異，表明各菌株抑菌活性相對穩定。

3 結論與討論

本試驗材料是從峨眉山海拔800 m左右的地方采集的天南星科健康植物異葉天南星，從根、莖、葉組織中共分離純化得到26株內生細菌，這26株內生細菌對MRSA均有抑菌活性，但不同菌株抑菌活性存在差異。初篩中平均抑菌圈直徑超過12 mm的菌株有12株，這12株菌株在復篩中仍然表現出較強的抑菌活性，其中YG009、YJ009對MRSA的抑菌活性最強，有進一步研究開發抗MRSA新藥的潛力。

從健康植株異葉天南星根、莖、葉中分別分離得到內生細菌，植株不同組織部位的內生細菌對病原菌MRSA的抑菌效果不同，從初篩、復篩結果來看，異葉天南星根、莖分離得到的內生細菌對MRSA的抑菌活性更強，這與異葉天南星主要以根入藥相吻合，同時表明莖可能也具有較好的藥用價值。

不同內生細菌在初篩、復篩試驗中對MRSA的抑菌活性相對穩定，表明這些內生細菌產生抗MRSA活性物質能力是可以穩定遺傳的。

參考文獻：

[1]宋良科. 峨眉山天南星科藥用植物資源研究[J]. 中國野生植物資源，2006，25（1）：35-36，52.

[2]趙 清，郭 輝，崔桂華. 幾種天南星科藥用植物的相似性研究[J]. 河北醫藥，2009，31（21）：2975-2977.

[3]孫紅祥，葉益萍. 天南星類藥材的綜合質量評價[J]. 生物數學學報，2003，18（2）：243-248.

[4]江 曙，錢大瑋，段金廒，等. 植物內生菌與道地藥材的相關性研究[J]. 中草藥，2008，39（8）：1268-1272.

[5]Hiramatsu K，Katayama Y，Yuzawa H，et al. Molecular genetics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. International Journal of Medical Microbiology，2002，292（2）：67-74.

[6]黃 輝，陳 穎，安如俊，等. MRSA中mecA及femB基因的檢測與耐藥相關性[J]. 微生物學雜志，2009，29（3）：54-56.

[7]王天昊，馬朋林. 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的管理：關注宿主[J]. 臨床藥物治療雜志，2012，9（5）：5-7.