鹽堿化草坪土壤耐鹽解磷真菌的篩選及解磷能力研究

李學平 劉萍 李甲亮 吳海楠

摘要：采集草坪根際鹽堿化土壤進行菌種篩選，并研究培養條件對菌株解磷效果的影響。試驗結果表明，真菌菌株FL0908發酵液中的有效磷濃度為310.23 mg/L，真菌解磷圈直徑與菌落直徑比值（D/d）達到1.96。菌株FL0908在所供4種碳源條件下均能生長，不同碳源生長差異顯著，最適碳源為葡萄糖，而在乳糖培養基上生長最差；對于所供4種氮源，在酵母浸膏上生長過于迅速，在亞硝酸鈉條件下幾乎不生長，最適氮源為酵母浸膏，硝酸鉀次之；對于所供4種溫度，真菌均可生長，最適溫度為30 ℃；在所供的4種pH值條件下可正常生長，最適pH值為6。對于試驗中發酵液條件的優化組合，最適解磷條件為：溫度35 ℃，pH值7，碳氮比35 ∶1，轉速130 r/min。

關鍵詞：解磷真菌；生物學特性；鹽堿土；根際

中圖分類號： S182 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0368-03

磷肥作為作物必需的營養物質對農業效益的提高具有重大作用，但是施入土壤后由于土壤的固定作用，大部分磷與土壤中的Ca2+、Fe3+、Al3+結合，形成難溶性磷酸鹽[1]，大大降低了肥料的有效性。在土壤性質、作物類型、磷肥種類和用量等一系列因素的影響下，每年施入的磷有75%～90%積累在土壤中成為難溶形態的磷[2]，當季利用率一般為10%～25%[3]；因此，如何提高磷肥利用率一直是研究人員關注的重要問題。解磷微生物是土壤中能將難溶性磷轉化為植物能夠吸收利用的可溶性磷的一類特殊功能微生物類群[4]。土壤中解磷微生物主要包括細菌、真菌和放線菌。關于解磷細菌的研究較多，也較深入[5-6]。關于解磷真菌方面的研究相對較少，但因為其具有解磷能力強的特點，一直也是研究的熱點[7]。對不同種類解磷微生物溶磷效果的研究發現，細菌、酵母、霉菌接種在不同磷源上時，表現出的溶磷能力不同[8-12]。解磷真菌在數量和種類上都少于解磷細菌，但其解磷能力遠遠高于解磷細菌，而且遺傳性狀更加穩定[13]。因此，研究解磷真菌的解磷特性以及生物學特性，對促進植物生長發育以及解磷真菌在農學上的應用有重要作用。本試驗采集草坪根際土壤，對解磷菌進行篩選并研究培養條件對菌株解磷效果的影響，同時對發酵液條件優化組合進行了研究，探討解磷真菌的最適生長環境以及解磷的最適合條件。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

采集內陸鹽堿地草坪根際土壤，采用抖土法將收集的土樣放入密封袋內立刻帶回實驗室冷藏，備用。

1.2 培養基配方

1.2.1 基礎培養基

菌種初篩用的是有機磷固體培養基和無機磷固體培養基。（1）有機磷固體培養基配方：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.003 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.01 g，CaCO3 5 g，卵磷脂 0.2 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.0～7.5。（2）無機磷固體培養基配方：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0003 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.01 g，Ca3（PO4）2 5 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值7.0～7.5。

1.2.2 保存培養基

菌種保存時用到的培養基為斜面培養基，其配方為：葡萄糖 15 g，NaNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，KCl 025 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，FeSO4·7H2O 0.005 g，瓊脂 8 g，蒸餾水500 mL，自然pH值。

1.2.3 復篩培養基 菌種復培（純化）時用的培養基為有機磷液體培養基和無機磷液體培養基。（1）有機磷液體培養基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.003 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 001 g，CaCO3 5 g，卵磷脂 0.2 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值 7.0～7.5。（2）無機磷液體培養基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.003 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.01 g，Ca3（PO4）2 5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值7.0～7.5。

1.2.4 活化培養基

經過觀察，獲知純化所得的菌種為真菌，所以活化時用到的培養基為PDA培養基，其配方為：葡萄糖 20 g，馬鈴薯（去皮）200 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。配制方法是將馬鈴薯去皮，切成小塊，于鍋中加水 1 000 mL，煮沸30 min，用雙層紗布過濾，取其濾液，之后加入葡萄糖和瓊脂，小火加熱并用玻璃棒不斷攪拌，至瓊脂完全溶解，并加水補足1 000 mL。

1.2.5 發酵培養基 發酵條件優化組合采用的培養基為無機培養基和有機培養基。（1）有機培養基配方：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.003 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.01 g，CaCO3 5 g，卵磷脂 0.2 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值7.0～75。（2）無機培養基配方：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.003 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.01 g，Ca（PO4）2 5 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值 7.0～7.5。

以上培養基制作完成之后均在高壓滅菌鍋中，于 121 ℃、0.103 MPa條件下滅菌20 min。

1.2.6 發酵條件優化組合

本試驗中發酵條件優化組合采用的是4因子（溫度、pH值、碳氮比、轉速）3水平的正交試驗（表1），根據試驗結果，綜合分析確定菌株生長的最適條件。

1.3 菌株篩選

1.3.1 初篩

按照培養基配方與配量分別稱取各藥品，取少于總量的水于燒杯中，將各培養基成分（瓊脂除外）逐一加入水中待溶；將玻璃杯放在石棉網上文火加熱，并不斷攪拌，使各藥品快速溶解，然后補充水分至所需配制培養基的量；用 1 mol/L 的NaOH調節pH值至7.0～7.5；將配制好的培養基分裝在錐形瓶內，加上棉塞包裝滅菌。高壓滅菌后倒平板，次日，將采集的土壤過篩磨細，稱取10 g樣品，進行梯度稀釋至1×10-7、1×10-8、1×10-9，分別滴加菌液于相應編號的平板表面，每個梯度做3個重復，用涂布器涂布均勻，20～30 min后倒置，并放于28 ℃恒溫箱中培養。每天觀察平板，并記錄菌落出現的日期、菌落解磷能力出現日期、菌落直徑d、解磷圈出現日期及直徑D。培養7 d后，得到解磷能力比較強的菌株進行純化培養，將純化培養幾代的菌株進行菌種保存。

1.3.2 復篩

采用液體發酵培養法，將解磷微生物培養在難溶性磷液體培養基上，按照配方配制液體培養基進行高壓滅菌，在超凈工作臺上，按照無菌接種法，接種純化后的解磷真菌于發酵液中，置于搖床中，在30 ℃、120 r/min轉速條件下培養7 d，每天觀察發酵液的變化，并記錄菌絲球的出現日期、菌絲球顏色、目測其大小。發酵結束后，進行發酵液有效磷測定。

1.3.3 生物學測定

本次試驗采用察氏培養基進行試驗，其配方如下：碳源30 g，NaNO3 2 g，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH值。

2 結果與分析

2.1 解磷真菌菌株篩選

通過菌種初篩和復篩，得到真菌菌株FL0908發酵液中的有效磷濃度為310.23 mg/L。真菌解磷圈直徑與菌落直徑比值（D/d）隨時間延長而增大，菌株FL0908在4 d增幅最大，在生長到5 d時，解磷圈直徑與菌落直徑比值（D/d）趨于穩定，菌株FL0908的D/d達到最大值1.96（表2）。

2.2 發酵培養性狀

通過觀察結果（表3）顯示，菌株FL0908的上清液較為透明，粗略判斷菌株FL0908的解磷能力較強。

2.3 培養條件對解磷能力的影響

2.3.1 不同碳源對真菌生長的影響 真菌菌株FL0908在供試的4種碳源營養條件下均能生長，生長趨勢基本一致，但是對葡萄糖的利用最好，對乳糖的利用最差（圖1）。不同碳源不僅對真菌菌株FL0908的菌落直徑影響較大，對菌絲體及菌落形態同樣產生較為顯著的影響。在葡萄糖培養基上，菌絲體較為粗壯，菌落濃密，在培養基背面產生較明顯的黑色次生代謝物；在蔗糖和乳糖培養基上生長出的菌絲比較稀疏，顏色亦較淺。

2.3.2 不同氮源對真菌生長的影響

不同氮源對真菌菌株FL0908生長的影響較大（圖2）。真菌菌株FL0908在NaNO2上基本不生長，在其他不同氮源培養基上均能生長。其中在酵母浸膏上生長過于迅速，在KNO3和NaNO3上能正常生長。從整個過程來看，真菌菌株FL0908在酵母浸膏培養基上生長最好，在NaNO2培養基上生長最差。不同氮源不僅對真菌菌株FL0908的菌落直徑影響較大，對其菌絲體及菌落形態同樣產生較為顯著的影響。真菌菌株FL0908在酵母浸膏和KNO3培養基上生長出比較濃密的菌絲；在NaNO2培養基上菌落顏色比較淡，菌落外圍形成白色的生長圈，而且菌絲變為黑色所需時間更長。

2.3.3 不同溫度對真菌生長的影響

真菌菌株FL0908在供試的4個不同溫度條件下均能生長，但在不同溫度條件下的生長狀況差異較顯著。在培養3 d內，真菌菌株FL0908在 35 ℃ 條件下生長最快，在20 ℃條件下生長最差，在培養3 d后，35 ℃條件下的菌落生長速率減慢；生長到 4 d后，在30 ℃條件下生長最好，在20 ℃條件下生長最差（圖3）。不同溫度對真菌菌株FL0908的菌絲體及菌落形態影響不顯著，在溫度為25、30、35 ℃條件下菌絲都比較濃密，在20 ℃條件下菌落顏色比較淡。

2.3.4 不同pH值對真菌生長的影響

真菌菌株FL0908在供試的4種pH值條件下均能生長，在培養3 d內，在pH值為6時生長最快，菌落直徑達到28 mm；生長到4 d時，pH值為5時菌落生長速率最快；綜合整個過程來看，在pH值為6時生長最好，在pH值為8時生長最差（圖4）。pH值為5、6、7這3種酸堿度下真菌菌株FL0908的菌落形態基本無顯著差異，菌落濃密；pH值為8時生長最差，顏色暗淡，菌落稀疏。

2.4 發酵條件研究

菌株FL0908不同試驗組發酵液有效磷含量差異較大（表4）。酸堿度的極差最大，是影響發酵液有效磷含量的關鍵性因子，碳氮比極差最小，對發酵液有效磷含量影響較小。根據各試驗因子的平均數可以看出：因素A選擇水平3，因素B選擇水平2，因素C選擇水平1，因素D選擇水平2，為最優組合，即溫度為35 ℃，pH值為7，碳氮比為35 ∶1，轉速為 130 r/min。

3 結論

篩選獲得1株解磷特性比較好的真菌菌株FL0908，對其解磷能力進行研究，真菌解磷圈直徑與菌落直徑比值（D/d）達到1.96。

真菌菌株FL0908在供試的4種碳源營養條件下均能生長，不同碳源條件下差異顯著，最適碳源為葡萄糖，而在乳糖培養基上生長最差；對于所供4種氮源，在酵母浸膏上生長過于迅速，在亞硝酸鈉條件下幾乎不生長，最適氮源為酵母浸膏，硝酸鉀次之。

對于所供4種溫度，真菌均可生長，菌株FL0908的最適溫度為30 ℃；在所供的4種pH值條件下可正常生長，最適酸堿度為pH值為6。

對于試驗中發酵液條件的優化組合，真菌菌株FL0908最適解磷條件為：溫度35 ℃，pH值7，碳氮比35 ∶1，轉速130 r/min。

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