竹蓀水提物的體外抗氧化活性研究

呂瑞 金蓮 周侯全

摘要：采用回流提取法對竹蓀中的水溶性成分進行提取，分別測定提取物的總還原能力及對·OH、DPPH·的清除作用，并與合成抗氧化劑維生素C進行比較。結(jié)果表明：竹蓀水提物對·OH、DPPH·具有不同程度的清除能力，但均低于維生素C。研究結(jié)果為竹蓀的抗氧化、抗衰老等作用的研究提供了一定參考。

關(guān)鍵詞：竹蓀；水提物；體外抗氧化；抗衰老作用；保健價值

中圖分類號：R284.1；S646.801 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0347-02

自由基又稱游離基，其性質(zhì)非常活潑，能與其他任何惰性物質(zhì)在惰性條件下發(fā)生連鎖反應(yīng)。存在于人體的自由基，在生理情況下能提高機體免疫力，而在病理情況下，則會對組織產(chǎn)生不可逆的損傷，直接導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生[1]。因此，從食物中尋找安全有效的清除自由基成分，成為了人們?nèi)諠u關(guān)心的問題。

竹蓀別稱竹參、面紗菌，為鬼筆科竹蓀屬真菌，是寄生在枯竹根部的一種隱花菌類，也是一種名貴的食用菌，具有滋補強壯、益氣補腦、寧神健體等功效，自古就被列為"草八珍"之一。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也證明，竹蓀中含有能抑制腫瘤的成分[2]；另有報道指出[3]，竹蓀中富含蛋白質(zhì)、脂肪、微量元素，此外還含有豐富的多糖，是難得的營養(yǎng)佳品。目前，對于竹蓀的研究多集中于對其抗菌作用的評價[4-5]以及多糖抗氧化作用的評價方面[6]，而未見關(guān)于其水溶性成分總體抗氧化作用的報道。由于竹蓀多以水溶性部位供人們食用，因此本研究以竹蓀水提物作為樣品，探索其對羥自由基（·OH）、DPPH自由基（DPPH·）的清除能力以及其總還原能力，以期為綜合評價竹蓀的食用、保健價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹蓀購于四川省綿陽市本地市場，經(jīng)綿陽師范學(xué)院天然藥物研究所邊清泉教授鑒定，為鬼筆科竹蓀屬植物竹蓀（Dictyophora indusiata）。

主要試劑為二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）（美國Sigma公司）、維生素C（四川科龍試劑有限公司）；硫酸亞鐵、雙氧水（30%）、鄰二氮菲、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙醇（95%）、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵，均為四川科倫試劑公司的分析純試劑。試驗用水為1次蒸餾水。

1.2 主要儀器

主要儀器為：UV-1700紫外分光光度計（日本島津公司）；800型高速離心機（江蘇省金壇市通濟儀器廠）；AY120 型電子分析天平（日本島津公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 竹蓀水提物的制備 將竹蓀洗凈烘干后，粉碎至過80目篩；準確稱取5.000 0 g竹蓀粉末于圓底燒瓶中，加入150 mL蒸餾水（料液比1 g ∶30 mL），于95 ℃下回流提取 2 h；過濾并將濾液濃縮后，用蒸餾水配制成濃度為5 g/L的溶液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 對照品維生素C溶液的配制 準確稱取0.500 0 g維生素C，用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，得濃度為5 g/L的溶液，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 羥基自由基（·OH）清除試驗 Fenton反應(yīng)是產(chǎn)生羥自由基的經(jīng)典反應(yīng)，其機理如下：

Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH-。

此體系產(chǎn)生的·OH，可使體系中橙紅色絡(luò)合物Fe2+-鄰二氮菲被氧化為Fe3+-鄰二氮菲，致使體系顏色變淺，從而在536 nm處的最大吸收峰消失。如果在加入H2O2前加入羥自由基清除劑，則Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基被清除或部分清除，此氧化過程受到抑制，使得該吸收波長下吸光度降低不明顯，因此可以通過測定536 nm處的吸光度來判斷受試物的抗氧化能力[7]。試驗設(shè)為5組：空白組、未損傷組、損傷組、樣參組、樣品組，對照品為維生素C。

按照表1所示加入反應(yīng)試劑，并分別加入不同體積提取液（0.2、0.6、1.0、1.4、1.6 mL），將各反應(yīng)管搖勻后，置于恒溫水浴中，于37 ℃下保溫60 min，于536 nm處測定吸光度，按下式計算羥自由基清除率：

·OH清除率=（D2-D1）-（D3-D4）D0-D3×100%。

式中：D0為未損傷管吸光度；D1為樣參管吸光度；D2為樣品管吸光度；D3為損傷管吸光度；D4為空白管吸光度。

1.3.4 DPPH自由基清除試驗 按表2的方法進行加樣，并加入不同體積提取液（0.2、0.6、1.0、1.4、1.6 mL），于室溫下避光反應(yīng)20 min，將對照組進行光譜掃描，以出現(xiàn)最大吸收峰的波長為測定波長。經(jīng)光譜掃描可知，DPPH自由基模型反應(yīng)中顯色產(chǎn)物的最大吸收波長為517 nm，因此選擇在517 nm下測定各組受試物的吸光度，以維生素C為對照品。

通過測定各溶液的吸光度，按下式計算自由基清除率：清除率=（D1-D2）-（D3-D4）D1-D2×100%。

式中：D1為模型組吸光度；D2為模型空白組吸光度；D3為樣品組吸光度；D4為樣參組吸光度。

1.3.5 總還原能力的測定 采用普魯士藍法[8]，取不同體積（0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0、2.2 mL）的樣品溶液于離心管中，加入2.5 mL pH值為6.6的磷酸鹽緩沖溶液、2.5 mL1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴保溫20 min；然后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，振蕩混勻后，于3 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL，加入5 mL 蒸餾水和1 mL 0.1% 的FeCl3溶液，混勻后反應(yīng)10 min，在700 nm處測定吸光度，并以相同濃度的維生素C水溶液作對照，每個濃度梯度樣品溶液平行測定3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 竹蓀水提物對·OH的清除作用

按照“1.3.3”節(jié)的方法測定各溶液吸光度，以添加樣品的體積為橫坐標、清除率為縱坐標作圖，比較竹蓀提取物和維生素C對·OH的清除效果，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在所選體積范圍內(nèi)，竹蓀水提物對·OH的清除率隨著加入體積的增加而增大并最終趨于平緩，說明其藥效漸趨飽和；而同濃度的維生素C在相同條件下清除率卻有明顯的量效關(guān)系。說明相較于維生素C而言，竹蓀水提物對·OH的清除能力較弱。羥自由基是生物體內(nèi)一種氧化能力很強的自由基，會造成機體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的氧化性損傷[9]，竹蓀水提物對羥自由基的清除能力較弱也在一定程度上說明了其對抗機體生物分子的氧化性損傷能力不夠強，而此結(jié)果還須要進行動物試驗進一步驗證。

2.2 竹蓀水提物對DPPH自由基的清除作用

按照“1.3.4”節(jié)的方法進行試驗，并以等濃度的維生素C作比較，通過測定各溶液吸光度，計算出相應(yīng)濃度下的清除率，分別以加入量、清除率為橫坐標、縱坐標作圖，詳見圖2。

從圖2可知，在所選的體積范圍內(nèi)，竹蓀水提物對DPPH自由基的清除率有明顯的量效關(guān)系，說明竹蓀水提物對DPPH自由基有一定的清除作用，但其清除能力不及相同條件下等濃度的維生素C對照品。有文獻報道，天然抗氧化劑清除DPPH·的能力在某種程度上被認為可以反映抗氧化劑的清除自由基總能力[10]，因此說明竹蓀水提物具有一定的自由基清除能力。

2.3 竹蓀水提物的總還原能力評價

按照“1.3.5”節(jié)的方法進行試驗，以吸光度為指標評價竹蓀水提物的總還原能力，并以等濃度維生素C作對照。以加入體積-吸光度建立坐標繪圖，得樣品和維生素C總還原能力的對比圖，詳見圖3。

從圖3可知，在試驗水提物的體積范圍內(nèi)，總還原能力隨著加入體積的增大而增強，但均低于相同條件下的維生素C，說明竹蓀具有一定的還原能力，雖不及還原劑維生素C，但此結(jié)果也可再次證明竹蓀水提物具有一定的抗氧化能力。

3 結(jié)論

本試驗采用回流提取法對竹蓀中水溶性成分進行了提取，并評價了提取物的總還原能力以及對·OH、DPPH·的清除能力。試驗結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，竹蓀水提物的總還原能力較強，但其對·OH清除能力較弱，而對DPPH·的清除能力較強，但其清除率均不及相同條件下的還原劑維生素C。結(jié)果說明，竹蓀水提物具有一定的抗氧化能力，由于竹蓀的食用部位多為其水溶性成分，因而可推斷食用竹蓀可起到抗氧化、抗衰老等作用，但其可靠的保健作用還須進行后續(xù)試驗驗證。

參考文獻：

[1]左 玉. 自由基、活性氧與疾病[J]. 糧食與油脂，2011（9）：9-11.

[2]林陳強，陳濟琛，林戎斌，等. 竹蓀資源綜合利用研究進展[J]. 中國食用菌，2011，30（2）：8-11.

[3]趙 凱，王飛娟，潘薛波，等. 紅托竹蓀菌托多糖的提取及抗腫瘤活性的初步研究[J]. 菌物學(xué)報，2008，27（2）：289-296.

[4]郝景雯，賈士儒，張 剛. 長裙竹蓀乙醇提取物與水提取物抑菌作用研究[J]. 食品研究與開發(fā)，2010，31（10）：8-10.

[5]譚敬軍. 竹蓀抑菌特性研究[J]. 食品科學(xué)，2001，22（9）：73-75.

[6]楊海龍，李 偉. 短裙竹蓀多糖清除O-2· 及對人紅細胞膜自由基氧化的影響[J]. 科技通報，2000，16（5）：371-374.

[7]文 鏡，賀素華，楊育穎，等. 保健食品清除自由基作用的體外測定方法和原理[J]. 食品科學(xué)，2004，25（1）：190-195.

[8]龔文靜，王 磊，邱 玥，等. 甜橙油抗氧化活性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（35）：21783-21784，22131.

[9]楊明惠，劉滿紅，何麗仙，等. 褪色光度法測定Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基及其應(yīng)用[J]. 分析試驗室，2006，25（12）：77-80.

[10]趙文紅，鄧澤元，范亞葦，等. 阿魏酸體外抗氧化作用研究[J]. 食品科學(xué)，2010，31（1）：219-223.