響應曲面法優(yōu)化分析甘薯不同肉色薯塊多酚的提取條件

胡春霞 顧東東 傅玉凡 趙櫻 楊春賢 曾令江

摘要：在優(yōu)化紫心、黃心、橘黃心和橘紅心4類肉色11個甘薯品種薯塊多酚提取條件的基礎上，運用響應曲面法進行乙醇體積分數(shù)、浸提時間和固液比3因素3水平Box-Behnken優(yōu)化設計試驗，以比較品種間最佳提取條件的差異。結果表明，11個甘薯品種薯塊多酚的最佳提取條件存在異同，需根據(jù)研究目的對多酚提取條件采取不同的策略與方法；對批量甘薯品種薯塊中的多酚含量高低進行評價時，可選取乙醇體積分數(shù)60%、浸提時間9 h、固液比 10 mg/mL 作為多酚通用提取條件。

關鍵詞：甘薯；薯塊；多酚；提取條件；響應曲面法

中圖分類號：TS201.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0276-05

植物多酚類物質具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗突變、DNA損傷修復等功能[1-2]，能阻止心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、骨質疏松癥、癌癥等許多慢性疾病的發(fā)生[3-5]。甘薯不僅是發(fā)展中國家的重要糧食、飼料和工業(yè)原料作物，而且其莖葉和薯塊中含有綠原酸、花色苷、黃酮等多酚類物質[6]，是多酚類物質新的較好來源[7]，這為甘薯產業(yè)開發(fā)提供了新思路。

響應曲面法（RSM）是一種對多種因素進行試驗設計能得到最佳條件的研究方法[8]，在甘薯多酚研究中已得到一定的應用，如Song等利用響應曲面法得到微波302 W、浸提時間123 s、乙醇體積分數(shù)53%甘薯葉片總酚微波輔助的提取方法[9]；陸國權等運用響應曲面法研究甘薯薯塊多酚提取條件認為，乙醇體積分數(shù)60%、物料比1 g ∶60 mL、80 ℃水浴下浸提88 min最佳[10]；Fan等利用響應曲面法得到提取溫度 80 ℃、提取時間60 min、固液比1 g ∶32 mL為紫心甘薯薯塊花青素的最佳提取條件[11]；韋學豐等對甘薯葉黃酮提取方法進行響應曲面法優(yōu)化，得到微波功率302 W、微波時間4 min、乙醇體積分數(shù)50%、固液比1 g ∶43 mL為最佳提取條件[12]。

甘薯多酚固有含量因品種、種植地點、栽培措施等不同而有差異，而對其含量測定時，也會受提取溶劑種類和濃度、浸提時間、提取溫度、固液比等因素影響[13-14]。前人在甘薯多酚提取時，多數(shù)是針對某一類肉色甘薯品種[15]或一類多酚[11]，針對不同肉色甘薯薯塊多酚通用提取條件的研究較少。本試驗選取紫心、黃心、橘黃心和橘紅心4類肉色的11個甘薯品種，采取25 ℃、振蕩輔助提取條件下進行乙醇體積分數(shù)、浸提時間和固液比3個單因素提取條件，利用響應曲面法對不同肉色甘薯薯塊多酚提取條件進行優(yōu)化與比較，為甘薯資源的多酚含量評價與篩選奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

11個不同肉色甘薯品種薯塊（表2）采自西南大學重慶市甘薯工程技術研究中心合川試驗基地。無水乙醇（分析純），重慶川東化工有限公司產品；無水碳酸鈉（分析純），成都市科龍化工試劑廠產品；福林酚（Folin-Ciocalteu）反應試劑、綠原酸（chlorogenic acid）標準品，Sigma公司產品。

1.2 儀器與設備

FW135型中草藥粉碎機，天津市斯特儀器有限公司生產；CM-2300D美能達色差計，日本美能達公司生產；BSA124S型電子分析天平，賽多利斯科學儀器北京有限公司生產；MIKRO 22R型離心機，Hettich Zentrifugen公司生產；HZ-8211K臺式空氣恒溫振蕩器，金壇市盛藍儀器制造有限公司生產；SY-2000旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠生產；T6新世紀型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司生產。

1.3 方法

1.3.1 樣品粉末的制備 薯塊收獲期，選用大小均勻一致的薯塊，清水洗凈，室溫下晾干；四分法取樣，切成1 cm×1 cm×1 cm 左右的薯粒，混勻，40 ℃條件下烘干至恒質量；將烘干薯粒粉碎，120目過篩，裝瓶，密封，-20 ℃低溫保存，備用。

1.3.2 甘薯薯塊粉末色度的測定 CM-2300D美能達色差計測定11個甘薯薯塊樣品粉末的L*、a*和b* 3個指標，計算C*值和h°值[16-17]。

1.3.3 樣液提取與制備 準確稱取0.300 0 g樣品粉末于帶塞錐形瓶中，加入一定體積不同體積分數(shù)的乙醇提取劑，25 ℃、100 r/min避光振蕩浸提一定時間；浸提液 5 000 r/min 離心20 min；取上清液，提取劑定容至50 mL；50 ℃ 旋轉蒸發(fā)乙醇至完全，超純水定容至50 mL。每個品種重復3次。

1.3.4 提取條件優(yōu)化 以乙醇體積分數(shù)60%、浸提時間 9 h、固液比10 mg/mL為基礎，改變任一條件進行單因素試驗，研究乙醇體積分數(shù)、浸提時間、固液比單因素對測定多酚含量的影響。乙醇體積分數(shù)設40%、50%、60%、70%、80% 5個水平；浸提時間設3、6、9、12、15、18 h 6個水平；固液比設4、7、10、13、16、19 mg/mL 6個水平。在單因素試驗基礎上，確定乙醇體積分數(shù)、浸提時間、固液比適宜的設計范圍，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件，進行3水平3因素 Box-Behnken 試驗設計（表2），并按照相應條件測定多酚含量，明確優(yōu)化的提取條件。

1.3.5 多酚含量測定

1.3.5.1 綠原酸標準曲線的制作 準確稱取3.04 mg綠原酸標準品，超純水溶解，定容至25 mL，配制成質量濃度為012 mg/mL標準溶液；將標準液分別稀釋成0.006、0.012、0024、0.049、0.073、0.097、0.120 mg/mL的溶液；分別取稀釋液1 mL，加入4 mL稀釋10倍的福林酚反應試劑，搖勻，靜置3 min；加入3 mL質量分數(shù)的20% Na2CO3，混勻，室溫、避光放置1 h，分光光度計750 nm處測定吸光度。以綠原酸質量濃度（x）為橫坐標，吸光值（y）為縱坐標作圖，得到線性方程y=7.280 7x+0.012 5（r2=0.998 8）。

1.3.5.2 多酚含量的測定 取1 mL各提取樣液，參照綠原酸標準曲線繪制過程，以空白為對照，750 nm處測定相應的吸光度，計算得到多酚含量，公式為：多酚含量（mg/100g）=50×（吸光度-0.012 5）×100/（0.300 0×7.280 7）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件，進行RSM試驗設計，并對所得結果進行方差分析和相關系數(shù)的計算等；采用SPSS 16.0軟件進行顯著性分析和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 甘薯薯塊粉末樣品的色度值

由表2可見，4個紫心品種的L*、a*、b*、C*和h°值差異達到極顯著性水平；除渝紫薯7號與徐薯22的b*值外，4個紫心品種的L*、b*和h°值均極顯著低于其他肉色薯塊相應的度量值，a*值極顯著高于其他肉色薯塊；L*、a*、b*、C*和h°值在其他肉色品種間表現(xiàn)有一定的交叉性。

2.2 甘薯多酚提取單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對多酚含量的影響 由圖1可知，提取的多酚含量隨乙醇體積分數(shù)的增加呈先上升、再減小或穩(wěn)定趨勢，乙醇體積分數(shù)對黃心、橘黃心和橘紅心類品種薯塊多酚的提取影響較大；渝紫薯7號、2010246、徐薯22在乙醇體積分數(shù)50%條件下提取的多酚含量相對最高，煙紫薯761在乙醇體積分數(shù)70%條件下提取的多酚含量相對最高，其他各品種均在乙醇體積分數(shù)60%下提取的多酚含量最高。

2.2.2 浸提時間對多酚含量的影響 由圖2可知，浸提9 h各品種得到的多酚含量達到最高；紫心和黃心甘薯在6～12 h內多酚含量差異不大，在此時間浸提多酚比較穩(wěn)定；浸提時間對橘黃心和橘紅心品種薯塊多酚含量的影響較大。

2.2.3 固液比對多酚含量的影響 由圖3可以看出，煙紫薯761在固液比7 mg/mL條件下得到的多酚含量相對最高，其他3個紫心品種在10 mg/mL條件下得到的多酚含量相對最高；黃心品種在固液比7～10 mg/mL范圍內得到的多酚含量相對最高，且較為穩(wěn)定；橘黃心品種渝薯17、南薯88在固液比4～10 mg/mL范圍內得到的多酚含量最高，且較為穩(wěn)定，而橘紅心品種薯塊在固液比10 mg/mL下得到的多酚含量相對最高。

2.3 響應曲面法優(yōu)化提取條件

2.3.1 響應曲面試驗結果的方差分析及相關系數(shù) 對測得的多酚含量（表3）進行方差分析，結果（表4）表明，所有品種2次回歸方程整體模型達到極顯著水平（P<0.01），能正確反映各品種多酚含量與各因素之間的關系； 各品種模型缺失值均大于0.05，說明所得實際方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小；用于模型分析的相關系數(shù)R2均大于0.9，說明該模型的相關度好，采用響應曲面法設計所得的回歸模型有效，適用于甘薯薯塊多酚含量的理論預測；除品種2010159外，提取劑乙醇體積分數(shù)對各品種多酚含量的提取均有顯著或極顯著性影響；浸提時間和固液比對多酚含量的提取因品種不同而異；在不同品種上，3個單因素的交互影響表現(xiàn)各有不同。

2.3.2 提取最優(yōu)條件 由表5可知，各品種最佳提取條件各不相同，除煙紫薯761外，乙醇體積分數(shù)多集中于50%～60%；除2010458外，浸提時間集中于9～12 h；固液比在7～10 mg/mL之間。

2.4 響應曲面最優(yōu)條件下預測值、實測值及60%、9 h、10 mg/mL 提取條件下多酚含量比較

由表6可知，響應曲面法所得各品種多酚的預測值，除煙紫薯761和徐薯22外，與實測值無顯著性差異，變異系數(shù)在0.53%～4.56%之間，相對較小；除煙紫薯761、徐薯22和南薯88外，其他8個甘薯品種最優(yōu)條件下實測值與乙醇體積分數(shù)60%、提取時間9 h、固液比10 mg/mL條件下測定的多酚含量無顯著性差異；乙醇體積分數(shù)60%、提取時間9 h、固液比10 mg/mL提取條件下，有72.73%的測試品種獲得較好的多酚含量，可用于薯塊高多酚含量甘薯種質資源的篩選。

2.5 多酚含量與色度值的相關性

由表7可知，所有甘薯品種之間薯塊多酚含量與色度值a*呈極顯著正相關，與L*、b*和h°呈極顯著負相關，而與C*無顯著相關性；紫心品種之間薯塊多酚含量與色度值a*、C*呈極顯著正相關，與L*、b*和h°呈顯著或極顯著負相關；黃

3 結論與討論

乙醇體積分數(shù)、浸提時間和固液比3個因素對11個不同心色品種薯塊多酚含量的提取影響程度不一樣，影響強弱為橘黃心薯塊和橘紅心薯塊）黃心薯塊>紫心薯塊。乙醇為提取溶劑更有利于多酚含量的提取，且乙醇具有低毒、易得等優(yōu)點，除2010246、渝紫薯7號、徐薯22和煙紫薯761，本試驗其他7個甘薯品種以乙醇作為溶劑提取多酚的最佳濃度為60%，與Wang等結果[18]基本相同；最佳浸提時間為9 h，與利用超聲波輔助[6]相比，提取時間相對較長；各薯塊品種最佳固液比集中于10 mg/mL，與師超等結論[19]相同。

響應曲面試驗設計所得11個薯塊品種的最優(yōu)多酚提取條件各有差異，其可能原因是一些種類的多酚在某些肉色甘薯中主要成分不同，如黃色、橙色和紫色甘薯中分別以黃酮、β-胡蘿卜素和花色苷[20]為主，從而導致多酚提取條件出現(xiàn)細微差異。另外，如果甘薯品種薯塊多酚含量較高，那么響應曲面設計所得最優(yōu)提取條件中乙醇體積分數(shù)會相應更高、浸提時間會相對更長、固液比也會相對減小。因此，對薯塊某一品種精確鑒定多酚含量時，需要使用多酚的最佳提取條件；而對批量資源多酚含量的相對高低進行比較時，則可采取乙醇體積分數(shù)60%、浸提時間9 h和固液比10 mg/mL的通用提取條件進行測定。

多酚物質能使植物器官呈現(xiàn)不同顏色。本試驗初步表明，不同肉色品種薯塊的多酚含量影響L*、a*、b*、C*、h°5個色度值指標，而同類肉色品種薯塊的多酚含量對薯塊的L*、a*、b*、C*、h°的影響也各不相同，這對通過利用便攜式色差計快速判定資源多酚含量的相對高低提供了一種新的思路。

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