犬細小病毒病DNA疫苗的研究進展

吳植　曹斌　王安平　王永娟　吳鵬　朱建華

摘要：犬細小病毒病是犬的一種具有高度接觸性的烈性傳染病。近年來，在犬細小病毒新型疫苗研究方面取得了新的進展，特別是DNA疫苗，筆者就犬細小病毒DNA疫苗的作用機理、抗原基因、載體選擇、分子佐劑的研究進展方面進行系列論述。

關鍵詞：犬；細小病毒；DNA疫苗

中圖分類號： S858.292.265+.5 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0231-03

犬細小病毒病是由犬細小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的一種急性傳染病，該病毒屬細小病毒科，細小病毒屬[1]。病毒經消化道感染健康犬后，主要攻擊2種細胞，一是腸上皮細胞，二是心肌細胞，分別表現出血性腸炎型和非化膿性心肌炎型，心肌炎以幼犬多見[2-3]。CPV自1978年被首次分離以來[4]，已在世界范圍內迅速傳播。目前，該病主要通過弱毒苗預防，但免疫效果不理想[5-6]，因此，新型基因工程疫苗逐漸成為研究的熱點，特別是DNA疫苗倍受國內外學者關注。

1 作用機理

DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是20世紀90年代Wolff等首創的新型疫苗[7]，把主要抗原基因克隆到真核質粒表達載體上，然后將重組的質粒DNA直接注入動物體內，使外源基因通過宿主細胞合成抗原蛋白，進而誘導宿主產生特異性免疫應答[8-9]。

DNA疫苗接種機體后，質粒被周圍的組織細胞（如肌細胞）抗原遞呈細胞（APC）或其他炎性細胞攝取，被吸收的質粒在機體啟動子作用下合成mRNA，并被細胞質中的酶復合物-蛋白酶體所降解，形成氨基酸肽段，然后經抗原轉運蛋白（TAP）轉運至內質網腔進一步修飾成氨基酸短肽[10]。這些短肽片段在內質網腔與新合成的MHC-Ⅰ分子的抗原結合槽相結合，形成抗原肽-MHC-分子復合物，并轉運至細胞表面作為免疫原信號肽供 CD8+細胞毒性T細胞（CTL）所識別，導致其活化、增值并分化為具有殺傷能力的效應 CTL，誘導產生較強的細胞免疫反應[11]。

另一部分蛋白抗原從分泌它們的APC的細胞膜上進入MHC-Ⅱ類型途徑，DNA疫苗基因表達的抗原蛋白未經加工被釋放出去由專職的APC攝取后，在細胞內經過吞噬體和溶酶體作用后被降解成具有抗原特異性的多肽，這些多肽同細胞內質網產生的 MHC-Ⅱ分子相結合并轉運到細胞膜上，被CD4+輔助性T細胞（Th）的受體識別。Th細胞分泌淋巴因子，刺激B 細胞轉化為漿細胞，產生抗體，誘導了抗原特異型的體液免疫應答[12]。

DNA疫苗具有許多優點：可同時誘導體液免疫和細胞免疫、可將含有不同抗原基因的質粒混合起來聯合免疫、可在同一載體上插入多種基因、可持續表達外源蛋白、易于構建和制備、穩定性好。近年來，在犬細小病毒病新型疫苗的研發中也顯示出其獨特的優勢。

2 抗原基因

CPV基因組主要編碼VP1和VP2 2種結構蛋白。VP2基因全長1 755 nt，編碼的584 氨基酸殘基組成的蛋白是構成衣殼的主要蛋白，約有60 個拷貝，VP2上的幾個關鍵堿基和氨基酸的變化就會改變抗原特性和宿主范圍[13]，表位圖譜試驗表明，結合中和抗體的全部抗原決定基因都在VP2中[14]。VP1基因全長2 256 bp，包含VP2基因的完整閱讀框架，2者的3′端完全重疊。VP1、VP2的序列基本相同，只是VP1的氨基端比VP2多一段氨基序列，這段序列中含有T細胞識別表位，能夠激發機體產生細胞免疫，而細胞介導的免疫應答反應是基因免疫誘導機體抵抗病原攻擊的一個重要機制。因此VP1、VP2都可以作為DNA疫苗的主要抗原基因。

Parrish等用含CPV VP1基因的真核表達質粒免疫犬，攻毒保護試驗證明基因疫苗能夠保護犬不被CPV感染[15]。Jiang W等構建了表達CPV VP1蛋白的真核表達載體pGT36VP1[16]，將5只9月齡的犬分別接種不同劑量的pGT36VP1，結果顯示免疫1周后，血清中可檢測到抗體IgG，2周左右達到峰值，約14周后抗體消失，所有免疫pGT36VP1疫苗的犬均能抵抗 CPV強毒的攻擊，而生理鹽水的對照組全部發病，證實了接種CPV VP1核酸疫苗能夠誘導機體產生抗CPV的特異性免疫反應。邱薇等構建真核表達載體pIRES VP1重組質粒也能抵抗 CPV強毒的攻擊[17]。

Gupta等含CPV VP2 DNA質粒表達載體免疫家犬獲得了較好的免疫反應[18]。韓冬梅等利用DNAstar軟件對CPV VP2基因以及編碼的氨基酸序列進行分析，確定了VP2蛋白抗原表位基因（VP2蛋白第490～559位氨基酸）[19]，即 VP2-70 構建了融合的真核表達載體pcDNACD5sp-LTB-VP2-70，也能夠誘導機體產生抗體IgG2a和IgG1，引起淋巴細胞增殖。

3 載體選擇

構建基因疫苗之前，載體的選擇十分重要。在CPV DNA疫苗中，常用的載體主要有invitrogen公司的pcDNA系列、pVAX1和Clontech公司的pIRES載體。pcDNA系列載體是常用的真核表達載體，其啟動子和增強子都源于巨細胞病毒（CMV），含有牛生長激素（BGH）轉錄終止序列，不同程度提高了目的基因的表達，但要注意的是插入的片段序列必須自帶ATG起始密碼子和TAG（或TGA、TAA）終止密碼子。pVAX1是在載體pcDNA3.1的基礎上改建而成的一種新型真核表達載體，是由美國食品和藥品管理委員會（FDA）推薦的唯一可以應用于人體試驗的核酸疫苗載體。謝之景等利用pVAX1載體構建了CPV DNA疫苗的真核表達質粒pVCPV能夠有效誘導小鼠產生抗CPV的特異性體液免疫和細胞免疫[20]。pIRES載體由于IRES元件的存在，可以同時表達2個基因。Patial等將狂犬病病毒的糖蛋白基因與犬細小病毒VP2基因連接到pIRES載體，構建了能同時表達2種抗原蛋白的雙順反子DNA疫苗，同時分別構建了2種抗原的單順反子 pIRES疫苗[21]。將雙順反子DNA疫苗免疫小鼠，并與單順反子疫苗的免疫效果進行比較。結果發現，2種DNA疫苗分別對狂犬病病毒和細小病毒的抗體中和反應效果相同，并能產生有效的免疫保護，證明該雙順反子DNA疫苗作犬用疫苗能夠有效誘導對狂犬病病毒和犬細小病毒的病毒中和反應。

4 分子佐劑

犬細小病毒病DNA疫苗與其他DNA病毒疫苗一樣，存在著免疫原性較弱，免疫動物后常常不能產生較強的保護性免疫反應。為了提高DNA疫苗的免疫效果，研究者們選用了不少分子佐劑來增強DNA疫苗的免疫原性，如CpG、熱應激蛋白（HSP）、白細胞介素類（IL）、大腸桿菌不耐熱腸毒素（LT）、集落刺激因子（GM-CSF）等[22-25]。

王璐等將pcDNA-VP2和pcDNA-cIL-2共免疫小鼠，35 d后血清中VP2的抗體水平（1 ∶5 120）極顯著高于單免疫組；淋巴細胞增殖試驗表明，單免疫組和共免疫組刺激指數均極顯著高于陰性對照組，共免疫組刺激指數又顯著高于單免疫組；共免疫組γ-干擾素的表達水平極顯著高于陰性對照組和單免疫組，cIL-2可顯著提高CPV VP2 DNA疫苗的應答水平[26]。孫巖等將pcDNA-CD5-VP2和pcDNA-cIL-7共免疫小鼠，結果表明，小鼠血清的抗體滴度和中和抗體效價分別極顯著和顯著高于單免疫組，對IgG2a和IgG1抗體的產生有明顯的促進作用；淋巴細胞刺激指數和γ-干擾素表達水平也顯著高于單免疫組，cIL-7可增強小鼠對VP2 DNA疫苗的免疫應答[27]。陳慧慧等研究表明，cIL-7和cIL-2對VP2 DNA疫苗免疫原性的增強作用具有協同效應[28]。潘素敏等研究表明，IL-12可顯著提高VP2 DNA疫苗的免疫應答水平[29]。

韓冬梅等研究證明，無論通過LTB基因表達載體與VP2抗原表達載體共免疫小鼠或利用LTB與抗原融合基因表達載體免疫小鼠，LTB基因均可明顯提高小鼠對VP2基因疫苗的體液免疫應答水平，但以LTB與VP2融合基因免疫效果明顯[19]。賈啟恒等研究證明，犬GM-CSF可明顯提高小鼠對VP2 DNA疫苗的體液免疫和細胞免疫的應答水平[30]。

5 展望

DNA疫苗是新興的一種疫苗，以其獨特地誘發機體高水平細胞免疫反應而倍受研究者關注，但是DNA疫苗在安全性的方面尚有爭議，如遺傳毒性作用即質粒DNA與宿主基因組整合的問題、表達抗原的載體自身可能有其他生物活性、致腫瘤性、自身免疫疾病等[31]。近年來，研究出的自殺性DNA疫苗，主要以甲病毒（主要是SFV和SINV）復制子為載體在基因免疫中得到廣泛應用[32-33]。實踐證明，這種以復制子為基礎的DNA疫苗優于常規DNA疫苗[34]。自殺性DNA疫苗的裂解性表達消除了DNA疫苗的動物機體內長期存在所帶來的各種隱患[35]。目前，犬細小病毒DNA疫苗的研究雖然道路曲折，但經過大量的實踐研究，仍然認為是可行的，DNA疫苗是新的發展方向，隨著科學研究的不斷深入，DNA疫苗在犬細小病毒病的免疫預防中一定會發揮更重要的作用。

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