茶多酚對豬精液低溫保存的影響

彭夏云 陸媚　許春榮　劉德玉　李銘　胡傳活

摘要：為了尋找一種可較好保護精子的低溫保護劑，改善豬精液低溫保存方法，通過在改進的豬精液低溫稀釋液中添加0、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL茶多酚，對比7 d內4 ℃下低溫保存豬精子的活率、活力、畸形率、質膜和頂體完整性等參數，探討茶多酚在豬精液低溫保存中應用的效果。結果表明，在豬精液低溫保存后7 d，僅0.50、1.00 mg/mL 組5個質量指標均顯著好于對照組（P<0.05），其中1.00 mg/mL組效果最好。總之，在本試驗條件下，適宜濃度的茶多酚可以明顯改善4 ℃低溫條件下豬精液的保存效果，其中最佳添加濃度是1.00 mg/mL。

關鍵詞：豬；精液；低溫保存；茶多酚；活力；畸形率；頂體完整性

中圖分類號：S828.3+4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0210-03

隨著我國養豬業的不斷發展和種豬聯合育種工作的需要，豬的人工授精迅速普及，豬精液品質的控制以及精液保存稀釋劑日趨成為豬人工授精技術的核心。然而，輸精后（尤其是用低溫冷凍后的精液）的受胎率卻很低，這與精子的受精能力有著重要的關聯[1]。精子作為一種復雜的終端細胞，必須具備一定條件才可以完成受精。從理論上說，當精液溫度下降到4 ℃或更低時，精子代謝活動水平降低，營養物質消耗減少，有利于延長精子的生命周期，達到長期保存的效果[2]；但是，在精液低溫保存過程中，由于精子質膜組成的不同，豬精子對溫度的改變非常敏感，對低溫的耐受能力比其他家畜差，易發生冷休克，使得精子處于氧化應激狀態，產生大量的活性氧，氧化精子質膜的不飽和脂肪酸導致膜脂流動性降低，最終導致精子細胞膜功能異常[3]、干擾精子代謝、損傷精子DNA[4]等，甚至誘發其凋亡[5]，這些局限在一定程度上限制了豬精液低溫保存技術的研究與應用。茶多酚是一類存在于茶樹中的多羥基酚類化合物的總稱[6]，近年來，了解到茶多酚的抗氧化作用不僅對體外的油脂而且對體內脂質體、蛋白質、DNA 等具有比其他天然抗氧化劑如維生素C、維生素E和化學合成抗氧化劑更強的保護作用[7]，但是目前未見其活性成分在豬精液保存方面應用的報道。本試驗將不同濃度茶多酚添加到稀釋液中，研究其對豬精液低溫保存的影響，以期為豬精液低溫保存稀釋液配方的改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及儀器 主要試劑：茶多酚（由上海源葉生物科技有限公司生產），考馬斯亮藍（由國藥集團化學試劑有限公司生產），葡萄糖、蔗糖（由國藥集團制藥總廠生產），青霉素、慶大霉素、碘化丙啶（Sigma中國有限公司），Diff-Quik染液（由南京建成生物工程研究所生產），卵黃（取自廣西南寧市富鳳農牧有限公司生產的初產雞蛋），新鮮豬精液（由廣西科達畜禽改良有限公司提供）。

主要儀器設備：邁郎精子全自動分析系統、相差顯微鏡（由南寧松景天倫生物科技有限公司生產），電子冷暖箱（由北京福意聯電器有限公司生產），冰箱（由河南新飛電器有限公司生產），電熱恒溫水槽（由上海精宏實驗設備有限公司生產），電子天平（由上海菁海儀器有限公司生產），恒溫載物臺（由江蘇省金壇市杰瑞爾電器有限公司生產）。

1.1.2 低溫稀釋液的配制 在徐振軍等報道的配方[8]基礎上稍作改進：蔗糖 4 g、葡萄糖 3 g、慶大霉素0.048 g、青霉素0.06 g、卵黃（7 000 g、15 ℃離心25 min，取上清液）20 mL，溶于80 mL雙蒸水中。

1.2 精液處理方法

1.2.1 精液采集 采用手握法采集精液，將預熱好的集精杯（35～37 ℃）用滅菌濾紙蓋好，收集中間段精液，邊采集邊過濾去除膠狀物。在37 ℃下用顯微鏡檢查常規品質，精子活力在0.7以上、無異味、色澤為乳白色的精液，放入保溫瓶中于1 h內運回實驗室備用。

1.2.2 精液稀釋與平衡 精液帶回實驗室后（室溫25 ℃左右），暗處靜置20 min，測量精液和稀釋液的溫度，確保二者的溫差為0.1～0.3 ℃。將含有各濃度茶多酚的低溫稀釋液（提前12 h配制好）按1 ∶1的比例緩慢加入到豬精液中，輕輕上下搖晃，使精液與稀釋液充分接觸，室溫23～25 ℃下暗處靜置平衡0.5 h；然后將低溫稀釋液（溫度保持25 ℃左右）按1 ∶1的比例再次加入上述已混勻的液體中，使得豬精液與稀釋液的最終稀釋比為1 ∶3；用數層紗布包裹后放入電子冷暖箱中17 ℃下平衡3 h，再次包裹數層紗布放入冰箱中4 ℃下保存，每6 h輕輕搖動1次，防止精子沉淀死亡。

1.3 精子質量評價

采用PI熒光染色法[9]檢測精子活率，計算機輔助精液分析儀（CASA）[9]檢測精子活力，Diff-Quik染色[10]檢測精子畸形率，考馬斯亮藍染色法[11]檢測精子頂體完整率，低滲腫脹法（HOST）[12]檢測質膜完整率。

1.4 試驗設計

試驗按茶多酚在低溫稀釋液的濃度（0、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL）分為5組，7 d內對精子的活率、活力、畸形率、彎尾率和頂體完整率進行測定，試驗重復5次。

1.5 數據處理

試驗數據先用Excel進行前期處理，然后用SPSS 17.0進行方差分析和多重比較，數據以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 茶多酚對低溫保存豬精子活率的影響

由表1可知，在4 ℃低溫條件下，0.50、1.00 mg/mL添加組7 d內均可以提高豬精子活率，其中1.00 mg/mL添加組效果更好，與對照組相比差異顯著（P<0.05）；1.50 mg/mL添加組從第3天開始對精子活率有顯著提高的作用；高濃度組（2.00 mg/mL）僅在第3、第4天可以顯著提高精子活率，其余時間與對照組差異不顯著（P>0.05）。

2.2 茶多酚對低溫保存豬精子活力的影響

由表2可知，在4 ℃低溫條件下，添加茶多酚各試驗組精子活力均高于對照組，但2.00 mg/mL添加組的活力在前4 d顯著高于對照組（P<0.05），第5天開始與對照組差異不顯著（P>0.05）；另外3組（0.50、1.00、1.50 mg/mL）7 d內的活力與對照組相比差異均顯著（P<0.05）。其中，1.00 mg/mL 添加組效果最佳，在第3天和第5天至第7天顯著優于對照組及各添加組（P<0.05）。

2.3 茶多酚對低溫保存豬精子畸形率的影響

由表3可知，在4 ℃低溫保存條件下，0.50、1.00 mg/mL添加組可顯著降低精子的畸形率（P<0.05）；1.50 mg/mL添加組的畸形率在保存的第3天至第5天顯著低于對照組（P<005）；高濃度添加組（2.00 mg/mL）的畸形率在7 d內與對照組相比差異不顯著（P>0.05）。

2.4 茶多酚對低溫保存豬精子頂體完整性的影響

由表4可知，高濃度組（2.00 mg/mL）的精子頂體完整從第2天開始顯著高于對照組（P<0.05）；其余3組的頂體完整率在7 d內均顯著高于對照組（P<0.05），其中0.50、1.00 mg/mL 濃度組效果較好，第6天時仍達50%以上。

2.5 茶多酚對低溫保存豬精子質膜完整性的影響

由表5可知，添加茶多酚各試驗組精子質膜完整率均高于對照組，但2.00 mg/mL濃度組與對照組相比差異不顯著（P>0.05）；1.50 mg/mL濃度組從第3天開始顯著高于對照組（P<0.05）；0.50、1.00 mg/mL濃度組能顯著提高精子質膜完整率（P<0.05），但這2組差異不顯著（P>0.05）。

3 結論與討論

精液在稀釋過程中暴露于空氣中，使得其氧氣濃度高于在生殖道內的氧氣濃度，體外操作時光線和溫度會發生變化，低溫保存過程中會發生低溫打擊，這些外界因素都會使豬精子細胞內活性氧水平增加，從而引起氧化應激損傷和脂質過氧化，導致精子結構和功能的損傷。本試驗結果表明，向豬精液稀釋液中添加茶多酚，對豬精子4 ℃低溫保存起較好的保護作用，可明顯提高低溫保存下豬精子的運動參數、頂體完整率以及質膜完整率效果最好的為1.00 mg/mL濃度組。茶多酚對豬精子低溫保存有這樣的保護作用，其原因可能與它的抗氧化機制有關。茶多酚作為優良的氫供體，向活潑自由基提供氫離子后形成的自由基通過共振雜化成穩定的自由基；而提供的氫離子與活潑自由基結合后，使得活潑自由基失活，切斷其鏈式反應，從而延緩油脂中不飽和脂肪酸自動氧化成過氧化物的連鎖反應，起到抗氧化作用。茶多酚的顯著抗氧化性在于還可以降低脂質過氧化物和丙二醛的含量，從而降低氧自由基對精子細胞的損傷[13]。另外，茶多酚最主要的活性成分為兒茶素類，其中沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）活性最強，同時具有抗氧化和抗凋亡作用。有研究表明，EGCG具有對抗β-淀粉樣蛋白誘致海馬神經細胞的凋亡作用[14]，并對過氧化氫、一氧化氮和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶等氧化應激因素誘導的PC12 細胞和SH-SY5Y 細胞凋亡模型具有抗凋亡作用[15-16]。EGCG抗細胞凋亡作用取決于其結構中含有2個三酚基團，該基團是其抗氧化作用的主要活性部位，通過增強抗氧化酶的活性加速氧化產物的轉化，同時阻止細胞氧化產物的大量生成，尤其是ROS的生成，減少對線粒體的氧化性損傷，而精子尾部節律性運動的能量主要來自線粒體呼吸代謝產生的ATP，這可能是其抗細胞凋亡的主要作用機制[15-16]。茶多酚的強抗氧化性和抗凋亡作用不容小覷，雖然本試驗結果也證明了它在豬精液低溫保存中的保護作用，但具體的更有說服力的機理和原因還有待于進一步探索。

適宜濃度的茶多酚均可以明顯改善4 ℃低溫條件下豬精液的保存效果，其中1.0 mg/mL濃度組對精子在7 d內的保存質量均起到提高作用，效果較好。

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