利用AFLP構(gòu)建棉花遺傳圖譜及纖維品質(zhì)性狀QTL分析

王志偉 魏利民 謝曉美 吳立強 +張貴寅

摘要：利用AFLP分子標記技術，以陸地棉（Gossypium hirsutum L.）品種中棉所8號與海島棉（Gossypium barbadense L.）品種Pima90雜交產(chǎn)生的F2群體為材料，構(gòu)建了包含11個連鎖群和86個標記位點（31個標記位點前人未曾報道）的連鎖圖譜，圖譜總長562.4 cM，約占棉花基因組的12.5%，標記間平均距離為6.5 cM。該圖譜有5個連鎖群被定位到相應的染色體上，6個連鎖群未定位于染色體上。應用復合區(qū)間作圖法分析F2單株和F2 ∶3家系的纖維品質(zhì)性狀，檢測到11個與纖維品質(zhì)有關的QTL，包括5個纖維長度（FL）、3個整齊度（FU）、1個馬克隆值（FM）、2個伸長率（FE）的QTL，分別解釋表型變異的17.7%～38.3%、16.3%～24.2%、24.7%、22.2%～46.5%。

關鍵詞：棉花；AFLP；遺傳圖譜；纖維品質(zhì)；QTL

中圖分類號： S562.03 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0071-03

棉花是重要的天然纖維作物，棉花產(chǎn)業(yè)在國民經(jīng)濟中占有重要的戰(zhàn)略地位。隨著社會進步和紡織技術的發(fā)展，對棉花纖維品質(zhì)要求也在逐步提高。棉花纖維品質(zhì)是數(shù)量性狀，纖維品質(zhì)和產(chǎn)量性狀之間存在負相關，以傳統(tǒng)的育種方法同步改良產(chǎn)量和品質(zhì)難度很大[1]。利用分子標記技術構(gòu)建高密度的分子遺傳圖譜，定位控制數(shù)量性狀的基因，進行標記輔助選擇育種，可顯著提高育種效率。目前，在棉花中利用分子標記技術已經(jīng)構(gòu)建了多張遺傳圖譜[2-8]，在棉花產(chǎn)量及其構(gòu)成因素、纖維品質(zhì)、部分形態(tài)性狀方面進行了QTL定位研究[9-14]；但是不同研究標記順序、圖距、QTL數(shù)量、位置和效應等方面都存在較大差異，不利于遺傳圖譜和QTL的整合[4]。本研究以海島棉與陸地棉雜交F2群體為材料，利用AFLP分子標記技術，進行遺傳圖譜構(gòu)建，并對纖維品質(zhì)性狀進行了QTL分析，為分子標記輔助選擇育種提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以中棉所8號和海島棉Pima90為親本配制雜交組合，2008年在河北保定種植F1代并自交，2009年種植F2獲得145個單株，將F2單株自交獲得F2 ∶3家系，2010—2011年，在河北保定、青縣2地分別種植F2 ∶3家系。親本、F1、F2單株及F2 ∶3家系的纖維樣品，包括纖維長度、整齊度、馬克隆值、伸長率送農(nóng)業(yè)部棉花品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心測定。

1.2 棉花基因組DNA提取及引物篩選

棉花總DNA提取參考Zhang等改進的CTAB方法[15]。AFLP標記所用的EcoRⅠ+3和MseⅠ+3的引物各10個，分別為E32（AAC）、E33（AAG）、E35（ACA）、E36（ACC）、E37（ACG）、E38（ACT）、E40（AGC）、E41（AGG）、E57（CGG）、E71（GGA）和M47（CAA）、M48（CAC）、M49（CAG）、M50（CAT）、M59（CTA）、M60（CTC）、M61（CTG）、M62（CTT）、M71（GGA）、M82（TAT），隨機組配成100對不同的引物。參考Marnik等的反應體系和擴增程序[16]，用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染法檢測擴增產(chǎn)物。由上海生工生物工程有限公司合成所有引物。

1.3 遺傳圖譜的構(gòu)建及纖維品質(zhì)性狀的QTL分析

利用Mapmarker/EXP（Version 3.0）進行標記連鎖分析，LOD最小值取3.0，最大遺傳距離為50 cM，采用Kosambi函數(shù)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。運用Windows QTL Cartographer 2.5軟件的復合區(qū)間作圖法[17]，檢測QTL的最低LOD值為2.5。QTL作用方式按Stuber等的標準[18]判定。利用繪圖軟件MapChart2.1繪制連鎖圖譜與QTL分布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及纖維品質(zhì)性狀分析

對親本和F2 ∶3家系纖維品質(zhì)性狀數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析（表1），中棉所8號的馬克隆值與伸長率明顯高于海島棉 Pima90，而纖維長度低于Pima90，雙親纖維品質(zhì)的差異為構(gòu)建遺傳圖譜和QTL定位奠定了基礎。4個纖維品質(zhì)性狀在F2 ∶3家系群體中均呈連續(xù)分布，表明這些性狀屬于多基因控制的數(shù)量性狀。偏度和峰度的計算結(jié)果表明分離群體纖維品質(zhì)相關性狀數(shù)據(jù)偏斜度絕對值均小于1，符合正態(tài)分布。纖維長度、馬克隆值和伸長率變異系數(shù)都在10%左右，說明這3個性狀在F2 ∶3家系間具有廣泛的遺傳變異。

2.2 AFLP引物的篩選及群體檢測

用雙親和F1的DNA對隨機組配的100對AFLP引物進行多態(tài)性篩選，共篩選出在親本中存在明顯多態(tài)性的引物20對，占篩選引物總數(shù)的20%，用這20對引物對F2群體進行檢測，共得到132個多態(tài)性標記。卡方測驗顯示，132個標記位點中有36個偏離孟德爾分離比例，占總標記的27.3%，定位到圖譜上12個。

2.3 連鎖圖譜的構(gòu)建

對132個標記位點進行連鎖分析，構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜包括86個標記和11個連鎖群，最長的為135.4 cM，最短的為21.6 cM，標記間平均距離為6.5 cM，圖譜總長562.4 cM，約占棉花基因組的12.5%。通過對已構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜進行比對[2，7，9，13]，11個連鎖群中有5個連鎖群定位到了染色體上，分別是Chr.4、Chr.9、Chr.12、Chr.14、Chr.25，其余6個連鎖群沒有定位到染色體或亞組上，暫定為LG1～LG6（圖1）。

2.4 纖維品質(zhì)性狀的QTL分析

通過復合區(qū)間作圖方法對棉花纖維品質(zhì)性狀進行QTL定位分析，共定位11個與纖維品質(zhì)性狀有關的QTL（表2），分布在Chr.4、Chr.9、Chr.12、Chr.25和LG1上。其中控制纖維長度的QTL有5個，位于Chr.9、Chr.12和Chr.25上，可解釋表型變異的17.7%～38.3%；控制整齊度的QTL有3個，位于Chr.12上，可解釋表型變異的16.3%～24.2%；只檢測到1個與馬克隆值相關的QTL，位于Chr.4上，可解釋表型變異的24.7%；檢測到2個與伸長率相關的QTL，位于Chr.9 和LG1上，可解釋表型變異的22.2%～46.5%。其中Chr.12上存在著2個纖維長度和整齊度的QTL重疊區(qū)間。

從|D|/|A|比值可知，5個纖維長度的QTL中，qFL1、qFL2、qFL3和qFL4均表現(xiàn)超顯性效應，qFL5表現(xiàn)為顯性效應；3個整齊度的QTL中，qFU1表現(xiàn)為顯性效應，qFU2和qFU3表現(xiàn)超顯性效應；馬克隆值的1個QTL表現(xiàn)超顯性效應；伸長率的2個QTLs，qFE1和qFE2均表現(xiàn)部分顯性效應。

3 討論

近年來，國內(nèi)外報道的遺傳圖譜中，利用海陸棉花雜交群體，Lacape等以RFLP-SSR-AFLP構(gòu)建了包含888個標記位點的圖譜[2]；Nguyen等以RFLP-SSR-AFLP構(gòu)建了包含1 160個標記位點的圖譜[3]；Wang等利用陸陸雜交群體，以RAPD-SSR-AFLP-SRAP構(gòu)建了包含132個標記位點的圖譜[5]。這些圖譜幾乎覆蓋異源四倍體棉花的全部基因組， 但是圖譜上空隙較多，利用AFLP標記較少，AFLP標記具有豐富的多態(tài)性，在基因組上均勻分布，可以充分填補圖譜上的空隙。通過與已有圖譜以及本實驗室已有結(jié)果進行比較[2-3，5，10，13]，本研究所構(gòu)建的包含86個AFLP標記、11個連鎖群的遺傳圖譜，其中有31個標記前人未曾報道，為進一步填補圖譜空隙、構(gòu)建飽和的高密度棉花圖譜奠定了基礎。

目前，在許多研究中發(fā)現(xiàn)控制棉花纖維品質(zhì)性狀和產(chǎn)量性狀的QTL有成簇分布在染色體（連鎖群）上的現(xiàn)象。張培通等在LGD08染色體上檢測出了9個控制產(chǎn)量的QTL[1]；Wang等在A01、D2和D6染色體上檢測出成簇分布的棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀的QTL[5]；He等在海陸雜交群體中發(fā)現(xiàn)，棉花重要經(jīng)濟性狀成簇分布在A3、A8和D9染色體上[11]。本研究發(fā)現(xiàn)在Chr.12上qFL2和qFU2存在著重疊區(qū)間，qFL3和qFU3存在著重疊區(qū)間。這種現(xiàn)象表明，控制不同纖維品質(zhì)性狀的基因可能緊密連鎖或一因多效，QTL可能會發(fā)揮其多重功能，一定程度上解釋了纖維品質(zhì)性狀間的表型相關，但是這種現(xiàn)象是基因連鎖還是一因多效還有待進一步研究。

本研究檢測出的關于纖維品質(zhì)性狀的QTLs中，有9個表現(xiàn)顯性和超顯性效應，顯性基因作用或者顯性與顯性基因的相互作用，對陸地棉和海島棉間進行漸滲雜交，有效轉(zhuǎn)移海島棉纖維品質(zhì)優(yōu)良基因提高陸地棉纖維品質(zhì)能夠起到一定的作用。

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