超高效液相串聯質譜法分析豬肉中殘留的15種β—受體激動劑

歐貝麗++倪偉華++鄒+燕++趙佳麗

摘要 [目的]應用超高效液相色譜串聯質譜技術建立同時測定豬肉中15種β-受體激動劑的檢測方法。[方法]樣品經β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解、0.2mol/L乙酸銨溶液（乙酸調pH至5.0）提取，陽離子固相萃取柱凈化，以0.01mol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）-甲醇為流動相梯度洗脫，C18柱為色譜柱進行分離，串聯質譜多反應檢測（MRM）模式測定。[結果]15種β-受體激動劑在5～100 ng/mL 濃度范圍內線性關系良好，3種添加水平下樣品平均回收率在74.2%～115.6%之間。[結論]該方法提取效率高，凈化效果好，具有良好的靈敏度和準確性，適合大批量豬肉樣品中15種β-受體激動劑的快速測定。

關鍵詞 超高效液相色譜-串聯質譜；豬肉；β-受體激動劑；固相萃取

中圖分類號 TS251.5+1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）12-0276-03

Determination of 15 β-agonists Residues in Pork by Ultra-performance Liquid Chromatography-mass Spectrometry

OU Bei-li NI Wei-hua ZOU Yan ZHAO Jia-li

（Jiaxing Institute for Food and Drug Control in Zhejiang Province，Jiaxing Zhejiang 314000）

Abstract [Objective]To develop a method for determination of 15β-agonists residues in pork by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry.[Method]The samples were enzyme hydrolyzed by β-Glucuronidase/aryl sulfatase，etracted with 0.2 mol/L Acetic acid-ammonium acetate buffering solution（pH=5.0），and cleaned up on a SPE cartridge，separated on a C18 column using 0.01mol/L ammonium acetate（contain 0.1% Formic Acid）- Methanol as mobile phase，and detected under multiple reaction monitoring（MRM）mode.[Results]The resultes displayed a good linearity for 15β-agonists over the range of 5～100 ng/mL.The mean recoveries were from 74.2% to 115.6% at three different concentrations.[Conclusion]The method was precise，sensitive，and highly efficient in extraction and purification，and it is suitable for fast analysis of β-agonists residues in a large number of pork samples.

Key words ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry；pork；β-agonists；solid phase extraction

β-受體激動劑，俗稱“瘦肉精”，是一類化學合成的結構和功能類似于腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇胺類衍生物，用于治療支氣管哮喘、平滑肌痙攣等疾病[1]。人們在研究過程中發現，其具有促進肌肉組織生長、減少脂肪沉積的作用，一些養殖戶為追求更大經濟效益在飼料中添加β-受體激動劑，以改善豬肉品質。但是由于這類藥物在飼料中的添加劑量較大，易在肉中殘留，人一次攝入一定量的高殘留的豬肉即可出現β-受體激動劑的毒副作用[2]，近年來食用β-受體激動劑殘留超標的肉類導致的中毒事件時有發生[3]。因此，該類食品安全問題已越來越受政府部門的重視，針對β-受體激動劑殘留的初篩和確證方法研究已成為近年來獸藥殘留研究的熱點[4-5]。本研究考察了15種常見的β-受體激動劑的提取凈化條件，最終建立了同時測定豬肉中15種β-受體激動劑的UPLC-MS/MS方法。該方法快速準確，適合大批量豬肉樣品中15種β-受體激動劑的快速測定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器。美國Waters公司 Acquity UPLC型超高效液相色譜、Quattro Premiere XE型三重四極桿串聯質譜、電噴霧離子化源（ESI）、MassLynx4.0數據處理系統、單道可調移液器（10～100 μL、100～1 000 μL、1 000～5 000 μL德國Eppendorf公司）、Milli-Q Academic純水系統（美國Millipore公司）、BP211D電子天平（德國Sartorius）KQ-500E型超聲提取儀（上海儀器有限公司）、F6/10超細勻漿器（上海弗魯克科技發展有限公司）、Mediwax固相萃取真空多聯器（美國艾杰爾科技有限公司）、多功能氮吹儀（北京同泰聯科技發展有限公司）、3-18K高速冷凍離心機（德國SIGMA公司）。

1.1.2 藥品與試劑。鹽酸克倫特羅、鹽酸妥洛特羅、硫酸沙丁胺醇、硫酸特布他林對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，β-鹽酸葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶購于美國sigma公司，溴代克倫特羅、馬布特羅、溴布特羅、西布特羅、氯丙那林、馬賁特羅、苯氧丙酚胺購于德國WITEGA Laboratorien Berlin，奧西那林、非諾特羅、克萊多巴胺、福莫特羅購于Dr.Ehrenstorfer（Augsburg，德國）。流動相所用甲醇、乙腈均為色譜純（德國，Merck公司），甲酸（純度為96%，TEDIA），乙酸銨（色譜純，TEDIA），試驗用水均為Millipore超純水器制備超純水。endprint

1.1.3 樣品。空白豬肉為經檢驗不含β-受體激動的肉，10批豬肉樣品，5批購自嘉興市各大超市，5批購自嘉興市農貿市場。將新鮮的空白豬肉和10批市售豬肉樣品絞碎并均質，于-18 ℃冰箱避光保存，臨用前于4 ℃冰箱解凍。

1.2 試驗方法

1.2.1 空白基質溶液的配制。稱取均質后的空白豬肉5.0 g于50 mL離心管中，加入約15 mL的0.2 mol/L乙酸銨-乙酸溶液（pH=5.0），渦旋混勻，超聲提取10 min，4 ℃條件下8 000 r/min離心5 min，上清液轉移至分液漏斗中，在提取液中加入正己烷，渦旋2 min，棄去正己烷層，保留提取液，作為空白基質提取液。

1.2.2 混合對照品溶液的制備。精確稱取鹽酸克倫特羅、鹽酸妥洛特羅、硫酸沙丁胺醇、硫酸特布他林、溴代克倫特羅、馬布特羅、溴布特羅、西布特羅、氯丙那林、馬賁特羅、苯氧丙酚胺、奧西那林、非諾特羅、克萊多巴胺、福莫特羅對照品各10.00 mg，于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成1 mg/mL對照品儲備溶液。分別吸取適量的各β-受體激動劑類藥物的對照品儲備液于刻度容量瓶中，用空白基質提取液稀釋并定容，配成質量濃度分別為5、10、20、40、80、100 ng/mL的混合對照品溶液，用于制作標準曲線。

1.2.3 樣品前處理。稱取均質試樣5.0 g于50 mL離心管中，加入約15 mL的0.2 mol/L乙酸銨-乙酸溶液（pH=5.0），再加入12 000 U的β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混合10 min，于37 ℃水浴避光酶解6 h，每隔1 h，漩渦混勻1次。酶解完后于4 ℃條件下8 000 r/min離心5 min，上清液轉移至雞心瓶內，在提取液中加入正己烷，渦旋2 min，棄去正己烷層，殘渣用10 mL的0.2 mol/L乙酸銨-乙酸溶液（pH=5.0）重復提取1次，再次加入正己烷脫脂，合并提取液，在37 ℃水浴中減壓旋轉蒸發至約2 mL，轉移至一干凈試管，用少量的0.2 mol/L乙酸銨-乙酸溶液（pH=5.0）洗滌雞心瓶2次，合并洗滌液于同一試管，待凈化濃縮。

Waters Oasis MCX柱依次用5 mL甲醇、5 mL水、2 mL 2%甲酸活化平衡，將上述提取液以0.25 mL/min的速度通過固相萃取柱，經3 mL的0.2 mol/L乙酸銨-乙酸溶液（pH=5.0）、3 mL的甲醇淋洗，棄去淋洗液，再用3 mL 5%氨水甲醇洗脫，重復洗脫1次，將洗脫液用氮吹儀于45 ℃濃縮至近干，用1.00 mL初始流動相溶解殘渣，經0.22 μm微孔濾膜濾過，供UPLC-MS/MS分析。

1.2.4 UPLC條件。色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column（2.1×100 mm，1.7 μm），流動相系統：A為甲醇溶液，B為10 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）水溶液，梯度洗脫（0～1 min，維持15%A；1～3 min，15%A線性變化至20%A；3～4 min，20%A線性變化至40%A；4～7 min，維持40%A；7～8 min，40% A線性變化至60%A；8～9 min，60%A線性變化至100%A；9～10 min，100%A線性變化至15%A）。流速為0.2 mL/min，柱溫為40 ℃，進樣量為5 μL。15種化合物的色譜分離情況見各MRM通道的疊加總離子流圖（圖1）。

1.2.5 質譜條件。離子源：ESI+；毛細管電壓（kV）：3.00；離子源溫度：120 ℃；RF透鏡電壓：0V；脫溶劑溫度：350 ℃；脫溶劑氣體流量：650 L/Hr；錐孔反吹氣流量：50 L/Hr；質量分析器：低端分辨率1（V）：13.0 V；高端分辨率1（V）：13.0 V；離子能量1（eV）：1.0；低端分辨率2（V）：13.0 V；高端分辨率2（V）：13.0 V；離子能量2（eV）：1.0。各種藥物的質譜采集參數見表1。

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優化

β-受體激動劑在動物體內吸收后，經過代謝后大多數會與硫酸酯蛋白和葡萄糖醛酸作用，以硫酸軛何物和葡萄糖醛酸軛合物等結合態形式存在，因此需要將其轉化為游離態進行檢測。β- 受體激動劑類藥物具有含氮堿性中心，在弱酸環境中能離子化，雖然β-鹽酸葡萄糖醛苷酶宜在pH 值7左右的環境中酶解，但是為了保證β-受體激動劑被提取出來游離在提取液中，因此選擇弱酸性的0.2 mol/L乙酸銨-乙酸溶液（pH=5.0）作為提取液。

2.2 色譜條件的優化

根據文獻[6]，大多β-受體激動劑類的色譜分離采用由0.1%甲酸溶液和甲醇或乙腈組成的混合溶液作為流動相，試驗比較了0.1%甲酸乙腈體系與0.1%甲酸-甲醇體系作為流動相時的情況，結果發現0.1%甲酸乙腈體系作為流動相時，沙丁胺醇、西布特羅、特布他林和奧西那林各通道之間有干擾（圖2），這些化合物在色譜柱上的保留不理想，化合物之間有相互轉化現象；在同樣梯度及色譜柱條件下，在流動相水相中加入少量乙酸銨（10 mmol/L），待測物得到有效分離，各通道之間無干擾，保證測定靈敏度的同時，化合物之間的分離度也得到進一步改善。

同時比較了Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column（2.1×100 mm，1.7 μm）和 Waters ACQUITY UPLC CSH C18 Column（2.1×100mm，1.7 μm）2種色譜柱對該類化合物的分離效果。結果表明，雖然BEH柱上的個別化合物的響應不如CSH柱上的響應高，但對15種化合物整體分離效果BEH更好些，因此選用BEH C18柱。

2.3 方法學考察

考察了標準曲線及相關系數、精密度、回收率和定量限。“1.2.2”項下配制的各濃度的混合對照品溶液，按“1.2.4”和“1.2.5”項條件進行分析，測得15個β-受體激動劑的峰面積，依據峰面積與濃度的關系繪制標準曲線，并計算獲得線性關系（表2）。可以看出，9種β-受體激動劑在5～100 ng/mL的 濃度范圍內均有良好的線性關系。用空白基質配制濃度均為50 ng/mL的混合標準溶液，考察日內精密度和日間精密度，日內精密度由7次重復測定得到，日間精密度由連續5 d重復取樣測定得到，結果樣品的日內精密度RSD均小于10%，日間精密度RSD均小于15%，均在可接受范圍內。在空白樣品中分別加入10、40、80 ng/mL混合標準溶液，渦旋混勻后，按“1.2.3”方法進行提取凈化，按“1.2.4”“1.2.5”條件測定回收率，結果見表2。采用標準溶液，空白基質提取液稀釋的方法，以S/N≥3時目標物的含量為該方法的檢出限，以S/N≥10時目標物的含量為該方法的定量限。經計算本方法測定15種β-受體激動劑的檢出限為0.01～0.12 μg/kg，定量限為0.05～0.38 μg/kg。endprint

2.4 樣品本底干擾的消除

由于豬肉基質復雜，對離子化有很強的促進或者抑制作用，為了消除樣品基質效應，以空白樣品提取液作為標準溶液的稀釋溶液，可以使標準品和樣品溶液具有同樣的離子化本底，從而消除了樣品的基質效應，使得該方法更加準確。

3 結論

10份樣品中5份檢出不同濃度的克倫特羅，1份檢出沙丁胺醇。其中，檢出克倫特羅的5份樣品有4份來自農貿市場，檢出沙丁胺春的樣品也購自農貿市場。農貿市場個體戶處購買的樣品，無論檢出概率和檢出量均大于大型超市購買的蓋有檢驗檢疫印章的樣品。

本方法建立了同時測定豬肉中15種β-受體激動劑殘留的超高效液相質譜聯用檢測方法。前處理過程中應用酶解方法進行提取，再經過混合陽離子交換柱進行凈化。該方法提取效率高，凈化效果好，具有良好的靈敏度和準確性，適合大批量豬肉樣品中15種β-受體激動劑的快速測定。

4 參考文獻

[1] SHELLEY R，SALPETER M D，NICHOLAS S，et a1.Meta-analysis：effect of long-actingβ-agonists on severe asthma exacerbations and asthma-related deaths [J].Annals of Internal Medicine，2006，144（12）：904-912.

[2] KOEBERL DD，LI ST，DAI J，et al.β2-Agonists enhance the efficacy of simultaneous enzyme replacement therapy in murine pompe disease [J].Mol Genet Metab，2012，105：221-227.

[3] 熊琳，李維紅，高雅琴，等.肉品中β-受體激動劑類藥物殘留檢測技術研究進展[J].食品安全質量檢測學報，2015，6（2）：528-533.

[4] 顏春榮，張波，方萍，等.豬肉中19種β-受體激動劑的液相色譜串聯四級桿-飛行時間質譜（Q-TOF）篩查和確證方法研究[J] .分析試驗室，2015，34（1）：35-39.

[5] 白艷艷，陳麗惠，賈玉琳.市售動物性食品中11種β-受體激動劑殘留結果分析[J] .中國衛生檢驗雜志，2014（22）：3289-3290.

[6] 劉敬先，苗翠，劉笑，等.超高效液相串聯質譜法分析牛肉中殘留的β-受體激動劑[J] .藥物分析雜志，2014，34（10）：1836-1841.endprint