辛開苦降法對脾胃濕熱證大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞p53、Bcl-2 蛋白的影響*

鄭春素，陳錦芳

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州350122）

王氏連樸飲具有清熱利濕的功效，為辛開苦降法的代表方劑，本研究以復(fù)合因素誘導(dǎo)復(fù)制大鼠脾胃濕熱證模型，通過胃腸病理取材確定胃黏膜病變程度，檢測p53、Bcl-2 蛋白等指標(biāo)，觀察王氏連樸飲治療后的變化情況，嘗試從分子生物學(xué)角度觀察脾胃濕熱證的本質(zhì)并揭示王氏連樸飲的相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康SPF 級(jí)SD 大鼠60 只，雄性，體重（200±20）g。（購自福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證：SCXK（閩）20150002）。傷寒沙門氏菌濃度：109CFU/mL（購自廣東省微生物研究所）。AvantiTM230 型超速冷凍離心機(jī)由美國BECKMAN 公司生產(chǎn)，即用型P53-抗體與Bc1-2-抗體由武漢博士德生物有限工程公司提供，酶標(biāo)定量測定儀由德國Thermo 公司生產(chǎn)。奧美拉唑（北京康蒂尼藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：040321）規(guī)格：20mg/片（購于福建省第二人民醫(yī)院西藥房）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脾胃濕熱證模型的制作

造模前各組動(dòng)物禁食12h，自由飲水。正常組大鼠以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)26 d，并生活在20～28°C、50%～70%相對濕度環(huán)境。其余5 組參照陳佩嬋[1]等人的脾胃濕熱證造模方法，給予高脂高糖飼料（普通飼料中混入12%豬油，8%蜂蜜加工而成）進(jìn)行喂養(yǎng)，10 d后在溫度（33±2）℃，相對濕度75%±5%的環(huán)境中生活，共7 d，然后以鼠傷寒沙門氏菌灌胃，劑量為10mL/kg，24 h 后再次灌胃，劑量為5mL/kg。

1.2.2 王氏連樸飲藥物的制備

參照《霍亂論》原方中藥物比例：蘆根60g，制厚樸6g，香豉、焦山梔各9g，川連、石菖蒲、制半夏各3g。以上藥物均由福建省第二人民醫(yī)院中藥房提供。上述藥物浸泡20min，入水量以覆蓋藥面2cm為度，先武火后文火煎煮約20min，濾去藥渣取澄清藥液。煎煮2 次后混勻并濃縮，保存在4°C 冰箱。

1.2.3 分組與給藥

大鼠分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，60 只SD 大鼠隨機(jī)分成正常組，生理鹽水組、奧美拉唑組、王氏連樸飲高、中、低劑量組6 組，每組10 只。正常對照組和模型組給予等容積生理鹽水，西藥組給予奧美拉唑濃縮液（1g/kg）灌胃；王氏連樸飲高、中、低劑量組分別按照不同濃度王氏連樸飲濃縮液（根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（按大鼠200g 體質(zhì)量計(jì)算）與人（70kg）的體表面積比轉(zhuǎn)換公式，5 倍給藥，王氏連樸飲高、中、低劑量組濃度為16.2g/kg，8.1g/kg，4.1g/kg。）10mL/kg 體質(zhì)量灌胃。每日1 次，連續(xù)灌胃1 周。

1.2.4 標(biāo)本采集

末次給藥后，各組大鼠不禁水，禁食12h，然后腹腔注射10%水合氯醛，大鼠麻醉后，剪取胃竇、大腸、十二指腸組織適量，于4%多聚甲酸溶液中，固定24h 以上，脫水，浸蠟，包埋，3μm 切片，HE 染色。

1.2.5 Bcl-2、P53 蛋白指標(biāo)檢測

釆用免疫組化SABC 法檢測大鼠胃黏膜Bcl-2、P53 蛋白的表達(dá)水平，染色具體操作參照試劑說明書。以PBS 代替一抗作陰性對照，以已知的陽性切片做陽性對照。結(jié)果判斷：細(xì)胞胞核呈棕黃色為p53 核表達(dá)呈陽性，細(xì)胞胞膜和胞漿呈棕黃色為Bcl-2 表達(dá)呈陽性。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0 軟件處理。計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 胃、十二指腸、大腸黏膜組織形態(tài)變化

HE 染色后，正常對照組大鼠胃黏膜層結(jié)構(gòu)完整，大腸、十二指腸柱狀上皮結(jié)構(gòu)完好，絨毛排列緊密。生理鹽水組大鼠胃黏膜組織表現(xiàn)為水腫和充血等改變，中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞可于黏膜下層和固有層中見到；大腸、十二指腸可見黏膜組織充血水腫，上皮脫落、壞死，炎細(xì)胞浸大量潤。與生理鹽水組相比，奧美拉唑組、王氏連樸飲高、中、低劑量組大鼠胃黏膜、十二指腸絨毛上皮結(jié)構(gòu)均完好（見圖1）。

2.2 各組大鼠Bcl-2，P53 蛋白的變化

生理鹽水組Bcl-2、P53 蛋白表達(dá)較正常組明顯增加，差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與生理鹽水組相比，奧美拉唑組、王氏連樸飲（高、中、低）劑量組Bcl-2，P53 蛋白表達(dá)降低，但王氏連樸飲低劑量組與奧美拉唑組間無顯著性差異（P>0.05），王氏連樸飲高劑量組優(yōu)于中低劑量組及奧美拉唑組，組間有顯著性差異（P＜0.05），見表1。

圖1 胃、十二指腸的組織學(xué)觀察（×200）

表1 各組大鼠Bcl-2、P53 蛋白的變化

3 討論

脾胃濕熱證在臨床中極為常見，既可由從外感受濕熱之邪所致，也可因脾胃虛弱或過食肥甘厚味、辛辣刺激之物，致使?jié)駸醿?nèi)蘊(yùn)中焦而成，病勢纏綿，病程較長，難以速愈。無論從理論還是臨床中，辛開苦降法對脾胃濕熱證的治療作用已經(jīng)得到了共識(shí)。王氏連樸飲出自王孟英的《霍亂論》，全方寒溫互用，為辛開苦降的代表方，治療脾胃濕熱證具有較好的效果。

現(xiàn)代研究證實(shí)胃黏膜結(jié)構(gòu)的完整性主要是由胃黏膜上皮細(xì)胞增殖、凋亡的平衡維持[2-5]。胃黏膜上皮細(xì)胞過度凋亡參與了胃黏膜損傷的發(fā)生過程。細(xì)胞凋亡是一個(gè)受基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程，涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用?，F(xiàn)代學(xué)者通過對胃腸道黏膜上皮細(xì)胞凋亡機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)胃腸道上皮細(xì)胞丟失的主要途徑為細(xì)胞凋亡；胃腸道上皮細(xì)胞凋亡與胃腸疾病的發(fā)生關(guān)系密切；細(xì)胞凋亡的調(diào)控主要有抑制細(xì)胞凋亡、促細(xì)胞凋亡、協(xié)助細(xì)胞凋亡三種基因[6-8]。脾胃濕熱證與消化系統(tǒng)疾病關(guān)系最為密切[9-15]，本研究表明模型組Bcl-2，P53 蛋白表達(dá)明顯增加，說明脾胃濕熱證的病變過程中細(xì)胞凋亡起了一定的作用，奧美拉唑組及王氏連樸飲各劑量組治療后均較治療前Bcl-2，P53 蛋白表達(dá)下降，說明藥物對脾胃濕熱證的改善機(jī)制可能通過影響細(xì)胞凋亡途徑發(fā)揮作用，王氏連樸飲高劑量組的Bcl-2，P53 蛋白表達(dá)與正常組無顯著差異，與王氏連樸飲中、低劑量相比，有顯著差異，說明王氏連樸飲對脾胃濕熱證的作用更加突出，從分子生物學(xué)角度探討辛開苦降法治療脾胃濕熱證的的作用機(jī)制有助于更好地研究治療脾胃濕熱證的藥物。

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