片仔癀通過PI3K/Akt 信號(hào)通路誘導(dǎo)人骨肉瘤U2OS 細(xì)胞凋亡*

林海英，劉俊寧，陳炳藝，李 楠，張 燕

（福建中醫(yī)藥大學(xué)骨傷學(xué)院，福建 福州350122）

骨肉瘤是一種好發(fā)于青少年的原發(fā)性骨源性惡性腫瘤[1]。腫瘤生長(zhǎng)迅速，可早期發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，同時(shí)還存在對(duì)化療藥物的多藥耐藥，因此盡管近30年來化療藥物和手術(shù)方式已取得重大的進(jìn)展，骨肉瘤5 年生存率并沒有得到明顯提高[2-3]。探尋有助于提高療效的藥物對(duì)骨肉瘤的治療有著積極的臨床意義。

傳統(tǒng)中藥片仔癀主要成分為三七、牛黃、麝香、蛇膽等，具有清熱解毒，消癰散結(jié)的功效。前期體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)片仔癀能夠有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，抑制骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移[4-6]。近年來發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B （Phosphatedayliositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路在骨肉瘤細(xì)胞的增殖、分化、存活和遷移等方面發(fā)揮作用，是重要的凋亡抑制通路[7]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)片仔癀在誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS 細(xì)胞凋亡過程中，PI3K/Akt 信號(hào)途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討片仔癀誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS 細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：15121250）；兔抗人Phospho-Akt（Thr473）單克隆抗體（美國(guó)CST 公司，批號(hào)：0019），兔抗人Akt 單克隆抗體（批號(hào)：0017）；兔抗人PARP單克隆抗體（批號(hào)：0007）兔抗人Cleave PARP 單克隆抗體（批號(hào)：0006）；PI3K 抗體試劑盒（批號(hào)：0000）；β-actin 抗體（批號(hào)：0002）均購(gòu)于美國(guó)CST公司；蛋白酶抑制劑Protease inhibitor cocktail（德國(guó)Merck Millipore 公司，批號(hào)：D00155412），磷酸酶抑制劑Phosstop（瑞士Roche 公司，批號(hào)：10995100）；高靈敏度化學(xué)發(fā)光底物Super signal West Femto（美國(guó)Thermo 公司，批號(hào)：PH204945）；Bio-Tex ELX 800 酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）；OlympusIX70 倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 株式會(huì)社）；GEL DOC 2000 凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.2 藥物配置

片仔癀（漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：600mg/粒，批號(hào)：1101007），將片仔癀粉末溶于PBS溶液中，使終濃度為30mg/mL，高壓滅菌，-20℃保存，使用前用培養(yǎng)基稀釋。

1.3 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

人骨肉瘤細(xì)胞株U2OS 由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院提供。人骨肉瘤U2OS 細(xì)胞置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱，含有10%的FBS、100U/mL 青霉素、100μg/mL 鏈霉素RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%～90%，0.25%的胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U2OS 細(xì)胞，0.25%胰酶消化，按1×104/孔接種于96 孔板，貼壁24h 后，以不加藥組為空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的片仔癀藥液，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。分別于干預(yù)24，48，72h 后，去除含藥培養(yǎng)基，每孔加入100μL 含MTT 的培養(yǎng)基（MTT 濃度為0.5 mg/mL），孵育4h 后棄MTT，每孔加入100μL DMSO，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱15min，震蕩使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀490nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。按照公式：抑制率=（1-藥物組平均吸光值/對(duì)照組平均吸光值）×100%，計(jì)算每組的生長(zhǎng)抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 Hoechst 33258 染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U2OS 細(xì)胞，以1×105/孔接種于12孔板，貼壁24h 后，加入不同濃度片仔癀溶液，并設(shè)空白對(duì)照組。干預(yù)48h 后，棄培養(yǎng)基，PBS 洗滌2次，每次3min，4%多聚甲醛室溫固定15min 后，去除固定液，PBS 洗滌2 次，每次3min。加入終濃度為10μg/mL Hoechst 33258 避光染色30min，再次用PBS 洗滌2 次，每次3min，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)的變化。

1.6 Western blot 法檢測(cè)PI3K p85α、p-PI3K p85α、Akt、p-Akt、PARP、Cleaved PARP 蛋白的表達(dá)

不同濃度片仔癀溶液干預(yù)U2OS 細(xì)胞48h，預(yù)冷PBS 洗細(xì)胞3 遍，盡量吸凈PBS 后加300μL 配置好的RIPA 裂解液[1mL 的RIPA 裂解液加10μL PMSF （100 ×）、10μL Protease inhibitor cocktail（100×）、100μL Phosstop（10×），現(xiàn)配現(xiàn)用]，提取總蛋白，BCA 法來測(cè)定蛋白濃度。5×蛋白上樣緩沖液將蛋白樣品變性，-20℃保存。每孔20μg 蛋白上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，室溫封閉2 h，分別加入不同稀釋比例的一抗，兔抗人β-actin（1 ∶1000）、PI3K p85α（1 ∶1000）、p-PI3K p85α（1 ∶1000）、Akt（1 ∶1000）、p-Akt（Thr473）（1 ∶2000）、PARP（1 ∶1000）、Cleave PARP（1 ∶1000），4 ℃?zhèn)葦[搖床過夜；TBST 洗滌3 遍，每遍10min；加入二抗（1 ∶2000 稀釋），室溫孵育1.5h；TBST 洗滌3遍，每遍10min；用Super signal West Femto 最高靈敏度化學(xué)發(fā)光底物顯色。Image Lab 3.0 軟件分析軟件進(jìn)行灰度掃描，目標(biāo)蛋白灰度值與β-actin 灰度值之比，作為目的蛋白表達(dá)水平的相對(duì)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用（x±s）表示，采用配對(duì)t 檢驗(yàn)和雙因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 片仔癀對(duì)U2OS 細(xì)胞增殖抑制作用

MTT 結(jié)果顯示片仔癀作用時(shí)間相同時(shí)，細(xì)胞抑制率隨著藥物濃度的增加而增大；而相同濃度片仔癀干預(yù)細(xì)胞，隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞抑制率逐漸增大，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明隨著片仔癀濃度的不斷增加，作用時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，對(duì)U2OS 細(xì)胞的增殖抑制率不斷升高（表1）。

表1 片仔癀對(duì)U2OS 細(xì)胞的抑制率（x±s，n=6）

2.2 片仔癀對(duì)U2OS 細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度片仔癀干預(yù)U2OS 細(xì)胞48h 后，Hoechst 33258 染色后熒光顯微下觀察見對(duì)照組細(xì)胞核呈圓形均勻的藍(lán)色熒光，片仔癀組表現(xiàn)為細(xì)胞核縮小，染色質(zhì)濃縮等典型的細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)，且隨藥物濃度的增大，凋亡細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞數(shù)目逐漸減少（圖1）。

圖1 Hoechst 33258 染色觀察片仔癀干預(yù)U2OS 細(xì)胞48h 后凋亡形態(tài)

2.3 片仔癀對(duì)U2OS 細(xì)胞PI3K p85α、p-PI3K p85α、Akt、p-Akt、PARP、Cleaved PARP 蛋白表達(dá)的影響

蛋白質(zhì)印跡方法檢測(cè)PI3K/Akt 信號(hào)途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)變化顯示，不同濃度片仔癀干預(yù)骨肉瘤U2OS 細(xì)胞48h 后，p-PI3K p85α 表達(dá)逐漸減少，0.8和1.2mg/mL 組與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.8mg/mL 組P＜0.05，1.2mg/mL P＜0.01），而PI3K p85α 基本保持不變；p-Akt 的表達(dá)隨藥物濃度的增加而減少，0.8 和1.2mg/mL 組與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.8mg/mL 組P＜0.05，1.2mg/mL 組P＜0.01），Akt 的表達(dá)變化不明顯；隨著藥物濃度的增加，PARP 的表達(dá)減少，尤其是1.2mg/mL 組，同時(shí)Cleaved PARP 表達(dá)量逐漸增多，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.4，0.8mg/mL 組P＜0.05，1.2mg/mL 組P＜0.01）。提示片仔癀誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS 細(xì)胞凋亡與減少p-PI3K p85α、p-Akt 蛋白表達(dá)，上調(diào)Cleaved PARP 表達(dá)量，調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)途徑有關(guān)（圖2）。

3 討論

骨肉瘤屬于中醫(yī)“石癰”、“石疽”、“石巖”等范疇，多發(fā)于青少年，局部表現(xiàn)為腫塊生長(zhǎng)迅速，持續(xù)性疼痛，皮溫高，靜脈怒張，全身則有低熱、貧血、乏力等。局部腫脹、靜脈怒張為瘀血之征，腫脹灼痛，刺痛拒按，皮溫升高，難消難潰，伴有發(fā)熱，屬痰瘀互結(jié)，熱毒內(nèi)蘊(yùn)，故臨床以“化瘀散結(jié)、清熱解毒”之法治療[8]。片仔癀由蛇膽、牛黃、三七、麝香等中藥組成，具有清熱解毒，消癰散結(jié)的功效，片仔癀治療惡性腫瘤具有明顯療效[9-10]。

圖2 片仔癀對(duì)骨肉瘤U2OS 細(xì)胞PI3K/Akt 信號(hào)途徑相關(guān)蛋白的影響

PI3K/Akt 信號(hào)途徑是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，該信號(hào)途徑的異常激活存在于多種人類腫瘤中，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和存活，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[11-12]。研究證實(shí)骨肉瘤中存在著PI3KCA 基因突變，從而激活PI3K 通路，與骨肉瘤惡性程度相關(guān)[13]；Fukaya 也發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中存在著Akt 的過度表達(dá)和活化[14]；王恒[15]研究發(fā)現(xiàn)通過抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路，能夠抑制骨肉瘤U2OS 的增殖、侵襲及遷移等腫瘤惡性特征，認(rèn)為PI3K/Akt 通路在骨肉瘤細(xì)胞的惡性表型中起到十分重要的作用。Perry 等[16]檢測(cè)了59 例骨肉瘤及正常組織的全外顯子組、全基因測(cè)序，通過分析基因組對(duì)骨肉瘤生存率的影響，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt 通路是骨肉瘤治療的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。

在PI3K 家族中，ⅠA 型PI3K 是由調(diào)控亞基p85 和催化亞基p110 組成的異二聚體，是目前研究最多，功能最廣泛，被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生關(guān)系最為密切的PI3K[17]。p85 調(diào)節(jié)亞基能夠穩(wěn)定p110 催化亞基，是ⅠA 型PI3K 激活所必須的。p85 調(diào)節(jié)亞基包括p85α、p85β、p85γ 三種，其中PI3Kp85α 是PI3K中含量最豐富的調(diào)節(jié)亞基。在生長(zhǎng)因子和激素刺激下，PI3Kp85α 通過其SH2 區(qū)域在細(xì)胞質(zhì)中與受體酪氨酸激酶磷酸化酪氨酸殘基結(jié)合，釋放出p110，活化的p110 催化磷脂酰肌醇4，5 二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)變?yōu)?，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），而PIP3 作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，是Akt 轉(zhuǎn)位于胞膜并被活化所必需的，從而促使Akt 持續(xù)磷酸化。Akt 的活化可以激活下游靶蛋白如Bcl-2 家族、細(xì)胞凋亡抑制蛋白，抑制天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族成員的活化，從而抑制細(xì)胞凋亡。

宮晨等[18]實(shí)驗(yàn)研究顯示PI3K/Akt 通路抑制劑LY294002 可明顯抑制人骨肉瘤MG63 類腫瘤干細(xì)胞的增殖，其作用可能通過抑制P13K 進(jìn)而抑制Akt 的磷酸化有關(guān)。4-HNE 可以改變Bcl-2/Bax 的比例，激活caspase-3 誘導(dǎo)骨肉瘤MG63 細(xì)胞凋亡，這一作用與抑制Akt 的活性密切相關(guān)[19]。從川續(xù)斷根中提取的ADAPW 可通過下調(diào)人骨肉瘤HOS 細(xì)胞PI3K 和Akt 磷酸化蛋白的表達(dá)，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，誘導(dǎo)其凋亡[20]。

前期研究表明片仔癀能夠有效抑制骨肉瘤U2OS 細(xì)胞的增殖，降低線粒體跨膜電位，改變線粒體通透性，增加Casepse-9、Caspase-3 的活性，下調(diào)Bcl-2 的表達(dá)促進(jìn)其凋亡[21]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)PI3K p85α、p-PI3K p85α、Akt、p-Akt 蛋白的表達(dá)，以觀察片仔癀對(duì)PI3K/Akt 信號(hào)途徑活性的影響。結(jié)果顯示片仔癀可濃度依賴性抑制骨肉瘤U2OS 細(xì)胞p-PI3K p85α 的表達(dá)，從而抑制了PI3K/Akt 信號(hào)途徑的激活，同時(shí)p-AKt 表達(dá)的下降進(jìn)一步印證了這一點(diǎn)。抑制PI3K/Akt 信號(hào)途徑，可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，我們?cè)贖oechst 33258 染色觀察片仔癀干預(yù)U2OS 細(xì)胞48h 后凋亡狀況中可以看到隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡增加。核多聚（ADP-核糖）聚合酶PARP，參與環(huán)境脅迫應(yīng)答中的DNA 修復(fù)，協(xié)助細(xì)胞維持生存能力，PARP 的裂解促進(jìn)細(xì)胞崩解并可以作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)記物。通過檢查測(cè)PARP、Cleaved-PARP 蛋白的表達(dá)，可以看到片仔癀可明顯促進(jìn)Cleaved-PARP 蛋白的表達(dá)。

綜上所述，片仔癀可通過抑制PI3K p85α、Akt蛋白磷酸化，抑制PI3K/Akt 信號(hào)途徑的激活，促進(jìn)PARP 的裂解，誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS 細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

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