犬冠狀病毒核衣殼蛋白的原核表達及間接ELISA檢測方法的建立

熊 煒，張 強，王 艷，陳政曉，蔣 靜，王巧全，陳 沁，李 健

（1.上海出入境檢驗檢疫局，上海 浦東 200135；2.上海大學生命科學學院，上海 寶山 200444）

犬冠狀病毒病是一種以胃腸炎為主要癥狀的高度接觸性傳染病，它由犬冠狀病毒（Canine coro?navirus，CCV）引起，臨床上以犬嚴重脫水、嘔吐、腹瀉和血便為主要特征，致死率較低，但與其他傳染病混合感染時，死亡率提高，對幼犬危害嚴重。目前，世界很多國家均已發現本病，是對養犬業危害較大的疫病之一。犬的健康與否與人類健康密切相關，以CCV為代表的冠狀病毒極易變異，導致冠狀病毒血清型眾多，且新的血清型還在不斷出現，為CCV的診斷和免疫預防帶來了更大的困難[1-2]。從1996年首次報道分離出CCV以來，國內學者對CCV的診斷方法和CCV主要蛋白的編碼基因進行了廣泛的研究，已報道的主要檢測方法有病毒分離、RT-PCR和核酸探針檢測等[2-5]，已報道的CCV功能基因的克隆和序列分析主要有TN449株的M基因、V1株的膜蛋白基因、部分S基因等[6-9]。本研究對CCV TN449株的核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，N）基因編碼序列進行克隆和表達，并將表達的CCV N蛋白包被ELI?SA反應板，建立了CCV血清間接ELISA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒株及陽性和陰性血清 CCV TN449株（ATCC編號：VR-989），由美國菌種保藏中心引進并保存。將該病毒在狗直腸瘤細胞系（A72）上擴增，取細胞裂解液備用。犬瘟熱病毒（CDV）、犬細小病毒（CPV）、犬副流感病毒（CPIV）、犬傳染性肝炎病毒（ICHV）、偽狂犬病病毒（PRV）和犬布魯菌（CB）的陽性血清由本室保存。

1.2 主要試劑 TRIZol、逆轉錄酶，購自Invitrogen公司；Taq酶，購自Stratagene公司；RNA酶抑制劑、dNTP、DNA Marker、蛋白Marker、T4 DNA連接酶，購自TaKaRa公司；限制性內切酶BamH I和Not I，購自NEB公司；大腸桿菌感受態細胞（Top 10F和BL 21）、質粒抽取試劑盒、膠回收試劑盒、辣根過氧化物酶標記的羊抗犬IgG、TMB試劑，均購自天根生化科技（北京）有限公司；蛋白表達產物純化采用GE公司HisTrap HP親和柱。

1.3 引物設計 參照GenBank中登錄的CCV TN449株的N基因序列（EF056485）設計引物，其上游引物（CCVNF）為：5′-CGGGGGCCAACCAGGGA CAACGCGTTAG-3′（BamH I），下游引物（CCVNR）為：5′-CCGGTTCGTTACCTCATCAATAATCTC-3′（Not I），擴增N基因大小為1149 bp。

1.4 RNA抽提和目的基因擴增 取200μL細胞裂解液進行RNA抽提，經反轉錄合成cDNA，采用PCR擴增目的基因。

1.5 目的基因和質粒載體的連接 PCR產物和質粒載體經BamH I和Not I酶切，并經膠回收純化后，使用T4 DNA連接酶進行連接，并轉化Top 10F大腸桿菌感受態細胞。

1.6 表達產物的SDS-PAGE電泳和Western Blot檢測 將IPTG誘導的重組菌樣品進行SDS-PAGE電泳，檢測重組蛋白的表達。將表達的重組蛋白利用HisTrap HP親和柱純化后，進行蛋白電泳，并將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，再使用CCV陽性血清和用辣根過氧化物酶標記的羊抗犬IgG作為二抗，對重組蛋白進行Western Blot鑒定。

1.7 抗原包被最佳濃度與血清最佳稀釋度的確定 采用方陣試驗測定。取純化CCV N蛋白（濃度4.0 μg/mL），用磷酸鹽緩沖包被液，按1∶2～1∶128進行稀釋，包被ELISA板，4℃過夜；用PBST洗滌后，加入40 g/L PEG20000，37℃封閉2 h；用PBST洗滌后，將CCV陽性和陰性血清按1∶100～1∶800倍比稀釋后，加入酶標板，37℃作用l h；用PBST洗滌后，加入1∶1000稀釋的羊抗犬HRPIgG，37℃作用1 h；用PBST洗滌后，加TMB顯色液，37℃作用15 min；最后加入H2SO4終止反應，讀取OD450nm值。以陽性血清OD450nm值接近1.0，P/N值（陽性血清OD450nm/陰性血清OD450nm）≥2.0的抗原最大稀釋度作為抗原最適工作濃度，其相應的血清稀釋度為最佳血清稀釋度。

1.8 間接ELISA陰陽性臨界值的確定 采用建立的間接ELISA方法對本室保存的126份犬CCV陰性血清樣本進行檢測。每份樣品重復3孔，結果取平均值，計算樣本OD450nm的平均值(-X)和標準差（SD）。根據統計學，樣本OD450nm值＞陰性樣本OD450nm值+2SD時，判定為陽性。

1.9 敏感性試驗 將CCV陰性和陽性血清做1∶50～1∶12800倍比稀釋后，用建立的間接ELISA方法進行檢測。

1.10 特異性試驗 用建立的CCV間接ELISA方法分別檢測CDV、CPV、CPIV、ICHV、PRV和CB的陽性血清，以驗證建立的間接ELISA方法是否對其他犬傳染病的陽性血清具有交叉反應性。

1.11 臨床樣品的復檢試驗 使用建立的CCV間接ELISA方法對本室保存的36份CCV陽性犬血清和14份CCV陰性犬血清進行復測，以驗證建立的間接ELISA方法的穩定性和可靠性。

2 結果

2.1 目的基因的RT-PCR擴增 將CCV TN449株在A72細胞上擴增，后提取細胞培養物中的RNA，采用RT-PCR對CCV的N基因進行擴增。結果顯示，擴增的目的片段約1200 bp，與預期結果（1166 bp）（圖1）。

圖1 RT-PCR擴增CCV N基因

2.2 目的基因的克隆及產物的酶切鑒定 將PCR產物膠回收后，與質粒載體連接，轉化感受態細胞，經平板篩選和酶切鑒定后，證實目的基因已重組入表達質粒（圖2）。經測序，質粒中目的基因與報道的TN449株N基因（EF05648）同源性為98.6%。

圖2 CCV的N基因重組質粒酶切鑒定

2.3 目的基因的表達及抗原性鑒定 將pETCCV-N1/BL 21重組菌進行6 h誘導表達，表達產物經SDS-PAGE進行分析。結果顯示，與空載體對照及未經IPTG誘導目的基因克隆菌的蛋白電泳圖相比，陽性克隆菌經IPTG誘導后，其電泳蛋白譜中出現了分子量大小為45 ku的目的基因表達產物（圖3）。將表達的目的蛋白產物經SDSPAGE電泳、轉膜，并使用CCV陽性血清進行Western-Blot分析，證實電泳蛋白譜中出現的45 ku的蛋白具有CCV蛋白的反應原性（圖4）。

圖3 CCV N基因表達產物的SDS-PAGE電泳圖

2.4 抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的確定 經方陣試驗測定，建立的CCV間接ELISA檢測方法中，當CCV陽性血清為l∶100稀釋、CCV N蛋白抗原的最佳包被濃度為1.0μg/mL（稀釋倍數1∶4）時，陽性血清的OD值接近于1.0，而陰性血清的OD值較低，分布于0.05～0.2之間，P/N值≥5.0。因此，確定CCV陽性血清的最佳工作濃度為1∶100，相應的CCV N蛋白抗原的最佳包被濃度為1.0μg/mL。

圖4 重組CCV N蛋白純化產物的Western-Blot分析

2.5 間接ELISA陰陽性臨界值的確定 在確定抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的基礎上，采用建立的間接ELISA方法對本室收集和保存的126份犬CCV陰性血清樣本進行檢測。結果顯示，這些血清的OD450值介于0.392至0.052間，其平均值為0.298，標準差SD為0.060，根據陰陽性臨界值=+2SD得出該陰陽性臨界值為0.418。因此，當待測樣品的OD450nm值≥0.418時為陽性，而OD450nm值＜0.418時為陰性。

2.6 間接ELISA敏感性試驗 將純化的CCV N蛋白抗原按最佳濃度和條件包被96孔板，再將CCV陰性和陽性血清分別做1∶50～1∶12800倍比稀釋后，加入96孔板進行間接ELISA檢測。結果顯示，CCV陽性血清1∶6400稀釋后仍檢測呈陽性，而經1∶12800稀釋后檢測呈陰性。

表1 間接ELISA敏感性試驗結果

2.7 間接ELISA特異性試驗 用建立的CCV間接ELISA方法對CCV、犬瘟熱病毒、犬細小病毒、犬副流感病毒、犬傳染性肝炎病毒、偽狂犬病病毒和犬布魯菌的陽性血清進行檢測。結果顯示，CCV陽性血清OD450值＞1.0，而其他病毒和細菌感染陽性動物的血清OD450nm值均＜0.418呈陰性，表明建立的間接ELISA方法具有良好的特異性。

2.8 臨床樣品的復檢試驗 使用建立的CCV間接ELISA方法對本室保存的36份CCV陽性犬血清和14份CCV陰性犬血清進行復檢。結果顯示，36份CCV陽性血清經間接ELISA檢測均呈陽性，而所有陰性血清經復檢均呈陰性，陰陽性符合率為100%。

3 討論

2004年肆虐全球的“非典”（Severe acute respi?ratory syndrome，SARS）是由一種新型冠狀病毒引起，它在世界上30多個國家不同程度的流行，導致了巨大的經濟損失。SARS病毒和CCV均來源于物種相近的犬貓科動物，加強對CCV的研究和檢測意義重大。本研究以美國ATCC引進的CCV參考毒株TN449株為對象，對其N蛋白編碼基因進行克隆和表達，并證實該體外表達和純化的N蛋白具有良好的抗原反應性；在獲取純化重組N蛋白基礎上，在其包被于ELISA反應板，建立了CCV抗體間接ELISA檢測方法，并確定了重組蛋白的最佳包被濃度、待檢血清的最佳濃度和陰陽性判定的臨界值。進一步將該間接ELISA方法用于多種常見犬病陽性血清的檢測，證實該方法具有良好的特異性；將該方法用于2006年至2012年本室收集并保存的36份CCV陽性血清和14份陰性血清的復檢，證實建立的間接ELISA方法具有良好的穩定性和可靠性，其陰陽性結果符合率為100%。

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