中藥成分對(duì)口蹄疫滅活苗免疫小鼠的脾臟指數(shù)淋巴細(xì)胞增殖及血清抗體水平的影響

王明周，王陳超，付 婉，涂君平，賀庭禎，彭遠(yuǎn)義，王自力

（1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 北碚 400715；2.貴州省三都水族自治縣農(nóng)村工作局，貴州 三都 558100；3.四川省綿陽(yáng)市涪城區(qū)畜牧獸醫(yī)局，四川 綿陽(yáng) 621000）

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性和可快速遠(yuǎn)距離傳播的主要侵染偶蹄動(dòng)物的疫病，易感動(dòng)物達(dá)70多種。感染動(dòng)物主以發(fā)熱、口腔黏膜及蹄部和乳房皮膚發(fā)生水皰，破潰后形成潰瘍或斑痂為特征，感染者發(fā)病率幾乎為100%，給畜牧業(yè)發(fā)展帶來(lái)了巨大損失。本文通過(guò)在O型-AsiaⅠ型FMD滅活苗中分別添加人參皂苷、靈芝多糖和枸杞多糖，比較含有不同中藥成分的FMD滅活苗對(duì)免疫小鼠的脾臟指數(shù)、淋巴細(xì)胞增殖、血清O型FMD抗體變化的影響，旨在探討不同中藥成分對(duì)接種FMD滅活苗小鼠的免疫機(jī)能的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 人參皂苷、靈芝多糖和枸杞多糖，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品；MTT、DMSO，Amresco公司產(chǎn)品；ConA、LPS，Sigma公司產(chǎn)品；小鼠淋巴細(xì)胞分離液中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所產(chǎn)品；牛口蹄疫O型、AsiaⅠ型二價(jià)滅活苗（OS株+JSL株），中牧實(shí)業(yè)蘭州生物藥廠產(chǎn)品；O型口蹄疫病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，武漢科技動(dòng)物生物制品有限公司產(chǎn)品；羊抗鼠酶標(biāo)二抗，上海希匹吉生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器設(shè)備 SW-CJ-2FD無(wú)菌操作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)；CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)賽默飛公司生產(chǎn)；BioRad 680型酶標(biāo)儀，美國(guó)伯樂(lè)公司生產(chǎn)；TDL-5A型低速離心機(jī)，金壇市精達(dá)儀器制造廠生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 含中藥成分牛FMD滅活苗的處理 分別稱取2 mg的人參皂苷、枸杞多糖、靈芝多糖，各自加入20 mL口蹄疫滅活苗中，于4℃條件無(wú)菌乳化30 min以上，直至其中藥成分完全溶解，人參皂苷、靈芝多糖和枸杞多糖濃度均為0.1 mg/mL。

1.3.2 動(dòng)物分組及處理 選取體重22 g～25 g昆明系小鼠（購(gòu)自中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）150只，雌雄各半，分為對(duì)照組、疫苗組、中藥成分+疫苗組（簡(jiǎn)稱人參皂苷組、靈芝多糖組和枸杞多糖組），每組30只。于正常條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)10 d后，分別于第1、15天給各中藥組小鼠后肢肌肉注射0.2 mL含0.1 mg/mL人參皂苷、靈芝多糖和枸杞多糖的牛O型-AsiaⅠ型FMD滅活苗，對(duì)照組和疫苗組小鼠則注射0.2 mL生理鹽水或FMD滅活苗。

1.3.3 脾臟指數(shù)測(cè)定 在第15、30、45天分別測(cè)定體重和脾臟重量，計(jì)算脾臟指數(shù)[1]：

1.3.4 脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定 參照文獻(xiàn)方法[2]，在接種疫苗后第45天時(shí)，體外分離培養(yǎng)各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖，即培養(yǎng)48 h后于每孔中加入100μL DMSO，于570 nm測(cè)定脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖OD值。

1.3.5 血清O型FMD抗體水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清O型口蹄疫抗體水平，試劑盒由豬O型口蹄疫抗體ELISA試劑盒改造而成，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定羊抗鼠酶標(biāo)二抗?jié)舛葹?∶2500，參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)以-X±S表示，用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差（one-way ANOVA）分析。

2 結(jié)果

2.1 脾臟指數(shù)變化 由表1可知，在第15天時(shí)各組小鼠脾臟指數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05）；在第30天時(shí)，靈芝多糖組脾臟指數(shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其余各組間均無(wú)顯著差別（P＞0.05）；第45天時(shí)，人參皂苷組和靈芝多糖組脾臟指數(shù)均顯著高于對(duì)照組和疫苗組（P＜0.05），且人參皂苷組小鼠脾臟指數(shù)最高（P＜0.05）。

表1 小鼠脾臟指數(shù)的變化 （n=10）

2.2 脾臟淋巴細(xì)胞增殖 由表2可知，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞經(jīng)ConA和LPS刺激后，人參皂苷組小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖均顯著高于其他各組（P＜0.05）；經(jīng)ConA刺激后，靈芝多糖組和枸杞多糖組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但與疫苗組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；經(jīng)LPS刺激后，靈芝多糖組和枸杞多糖組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），顯著低于疫苗組和人參皂甙組（P＜0.05）。

表2 小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖 （n=10）

2.3 O型FMD血清口蹄疫抗體水平變化 由表3可知，在第15天時(shí)，各組小鼠的血清抗體水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）。第30天時(shí)，人參皂苷組血清FMD抗體水平顯著高于對(duì)照組、疫苗組（P＜0.05），靈芝多糖和枸杞多糖組小鼠血清FMD抗體水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但對(duì)照組和疫苗組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。在第45天時(shí)，人參皂苷和靈芝多糖組血清FMD抗體水平顯著高于對(duì)照組、疫苗組和枸杞多糖組（P＜0.05），且兩組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；枸杞多糖組、疫苗組與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表3 血清O型FM D抗體水平檢測(cè) （OD值）

3 分析與討論

3.1 小鼠接種含中藥成分的FMD滅活苗后脾臟指數(shù)變化 脾臟作為機(jī)體重要的免疫器官，脾臟指數(shù)在一定程度上能反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱，因此，脾臟指數(shù)可作為反映動(dòng)物機(jī)體免疫機(jī)能的客觀指標(biāo)之一[1]。本研究結(jié)果顯示，在第30天，靈芝多糖組的脾臟指數(shù)最高；在第45天，人參皂苷組、靈芝多糖組的小鼠脾臟指數(shù)均顯著高于對(duì)照組和疫苗組（P＜0.05），說(shuō)明人參皂苷、靈芝多糖可顯著提高小鼠免疫機(jī)能，枸杞多糖對(duì)小鼠免疫FMD滅活苗有一定的促進(jìn)作用。

研究表明，人參皂苷具有提高受輻射大鼠外周血白細(xì)胞數(shù)、胸腺及脾臟細(xì)胞數(shù)，具有防輻射致傷免疫器官的作用，可增強(qiáng)機(jī)體防御能力[3]；靈芝多糖通過(guò)影響免疫相關(guān)細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，提升脾臟和胸腺指數(shù)，上調(diào)血清中IL-2和TNF-α的表達(dá)水平，發(fā)揮對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用[4-5]。枸杞多糖具有增加外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞和增加細(xì)胞因子IL-2的分泌的作用[6]，可形成較強(qiáng)的免疫活性，是有效的免疫增強(qiáng)劑，在細(xì)胞免疫和體液免疫中具有十分重要作用。

3.2 中藥成分對(duì)小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響 T細(xì)胞是介導(dǎo)細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞，其增殖可提升細(xì)胞免疫強(qiáng)度，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。B細(xì)胞是介導(dǎo)體液免疫的主要細(xì)胞，在體液免疫中B淋巴細(xì)胞發(fā)展為漿細(xì)胞并產(chǎn)生抗體而增強(qiáng)機(jī)體的免疫力[7]。ConA是誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖的刺激劑，在經(jīng)過(guò)ConA刺激后，人參皂苷組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖最顯著（P＜0.05），與其他各組存在顯著性差異；疫苗組、靈芝多糖組和枸杞多糖組均高于對(duì)照組且有顯著性差異，而3組之間沒(méi)有顯著性差異。說(shuō)明人參皂苷能顯著增強(qiáng)口蹄疫苗免疫的小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的免疫機(jī)能；靈芝多糖和枸杞多糖對(duì)免疫FMD滅活苗的小鼠脾臟T細(xì)胞的免疫機(jī)能沒(méi)有明顯促進(jìn)作用。

LPS是誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖的刺激劑，在經(jīng)過(guò)LPS刺激后，人參皂苷組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞相比于對(duì)照組和疫苗組出現(xiàn)了顯著增殖。靈芝多糖組和枸杞多糖組的小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖均顯著低于疫苗組但顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。研究表明，靈芝多糖具有促進(jìn)人T細(xì)胞增殖、分泌INF-γ以及抑制T細(xì)胞凋亡的功能[9]；枸杞多糖能使照射所致小鼠B淋巴細(xì)胞對(duì)有絲分裂原誘導(dǎo)的反應(yīng)性恢復(fù)，對(duì)異型抗原的特異性反應(yīng)以及對(duì)胸腺依賴抗原SRBC的特異性抗體反應(yīng)都有明顯的恢復(fù)[9]；人參皂苷能極顯著增強(qiáng)小鼠外周T淋巴細(xì)胞增殖[10]和提高抗雞新城疫病毒抗體的產(chǎn)生[11]。

3.3 小鼠血清O型FMD抗體水平的變化 機(jī)體血清中免疫球蛋白的含量變化直接體現(xiàn)出了體液免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)，血清抗體中的IgM在初次應(yīng)答中占優(yōu)勢(shì)，即對(duì)早期階段的機(jī)體免疫調(diào)節(jié)具有重要影響。研究表明，不同的血清抗體水平與動(dòng)物的免疫保護(hù)有著極大的關(guān)系[12]。

在給小鼠注射牛口蹄疫滅活疫苗后，人參皂苷組小鼠血清抗體水平均顯著高于對(duì)照組和疫苗組（P＜0.05），表明人參皂甙具有明顯的免疫增強(qiáng)效果；靈芝多糖組和枸杞多糖組的抗體水平在試驗(yàn)期間呈上升趨勢(shì)，表明靈芝多糖和枸杞多糖亦可有效增強(qiáng)小鼠FMD免疫效果。研究表明，人參皂苷能顯著提高機(jī)體血清中Vero-細(xì)胞狂犬病疫苗的抗體水平進(jìn)而可減少其免疫次數(shù)[13]；靈芝多糖可通過(guò)促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的活化增殖以及神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)加強(qiáng)細(xì)胞免疫、體液免疫亦有一定促進(jìn)作用[14]。此外，枸杞多糖也有明顯改善機(jī)體的體液免疫的功效[15]。

綜上所述，人參皂苷對(duì)牛O型-AsiaⅠ型FMD滅活苗免疫后小鼠的脾臟指數(shù)、脾臟淋巴細(xì)胞增殖及血清O型FMD抗體水平均具有顯著的增強(qiáng)作用；靈芝多糖對(duì)牛O型-AsiaⅠ型FMD滅活苗免疫后小鼠的脾臟指數(shù)、脾臟淋巴細(xì)胞增殖及血清O型FMD抗體水平均具有顯著的增強(qiáng)作用；枸杞多糖對(duì)試驗(yàn)小鼠的免疫機(jī)能具有一定的促進(jìn)作用。

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