江蘇地區犬細小病毒的分離與變異分析

甘軍紀，榮燕琴，甘天喻，劉文博，王 亨，劉秀梵

（1.揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州 225009；2.蘇州艾貝爾寵物醫院，江蘇 蘇州 215000）

犬細小病毒2型（CPV-2）是一種最常見的引起幼犬急性出血性腸炎的病毒，病毒直徑23～26 nm，為單鏈DNA病毒，基因組全長大約5200 nt[1]。自從1978年世界上首次從病犬中分離到犬細小病毒（CPV-2）以來，該病毒的抗原持續變異，先后出現CPV-2a型、CPV-2b型病毒并迅速流行，完全取代了CPV-2[2]。2001年在意大利又出現了CPV-2c型病毒并快速傳播到許多國家[3]。世界上不同的國家流行不同的優勢CPV病毒型，如意大利、德國、西班牙以CPV-2c占優勢，在英國、希臘和保加利亞CPV-2a/2b都有較高的檢測頻率，而在亞洲以CPV-2a為主，僅越南、中國和印度檢測到CPV-2c變異株[4-6]。為了進一步了解近年來江蘇地區的CPV流行情況，我們對江蘇省部分地區2007-2013年病犬臨床樣本進行了CPV分離鑒定并對其VP2關鍵氨基酸的變異進行了分析。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品 分別在揚州大學動物醫院和蘇州市某寵物醫院收集CPV快速檢測試劑盒檢測陽性的犬糞便樣品，-20℃凍存備用。

1.2 病毒分離培養 樣品用0.22μm針頭濾器過濾除菌，接種FK81細胞，吸附30 min，加入1%FCS-DMEM培養基繼續培養。每天觀察細胞病變（CPE），培養3～4 d，當80%細胞出現CPE時，收獲細胞和培養液。

1.3 病毒DNA提取 CPV分離毒株和疫苗毒株分別接種FK81細胞，連傳2代，收獲細胞培養液，用EasyPure?Viral DNA/RNA Kit試劑盒抽提病毒DNA。

1.4 PCR擴增與NDA測序 VP2基因擴增引物設計按文獻[3]，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，Hfor：5′-CAGGTGATGAATTTGCTACA-3′，Hrev：5′-CATTTGGATAAACTGGTGGT-3′。擴增預期片段630 bp（位置3556～4185 nt）。從電泳凝膠中切下目的條帶，直接送上海生工生物工程技術服務有限公司進行NDA測序。

1.5 病毒分離株類型 從GenBank獲取CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c參考序列。使用 DNA?Star軟件中的MegAlign程序對所測的11個分離株和1個疫苗株VP2基因序列與GenBank獲得的VP2基因序列進行比對。根據VP2蛋白6個重要信息氨基酸殘基（297，300，305，324，426和440）的變化，確定變異株類型。

1.6 遺傳進化分析 使用MEGA4.0對CPV分離株和參考株VP2基因序列進行多序列比對，基于鄰接法（Neighbor-joining）構建系統種系發生樹。

2 結果

2.1 病毒分離 2007-2013年，在揚州（YZ）和蘇州（SZ）地區共獲得11個CPV分離株，其中2007年1株（YZ0701L），2010年3株（YZ10-3，YZ10-4，YZ10-5），2013年 7株（YZ1311Z，YZ1311-1，YZ1311-2，YZ1312-2，SZ1301，SZ1303，SZ1305）。

2.2 VP2基因片段的PCR擴增 11個CPV分離株和1個疫苗株（CPV-F1）的細胞培養物，抽提DNA，用Hfor/Hrev為引物進行PCR，均擴增到630 bp的VP2基因產物，見圖1。

圖1 CPV分離毒株VP2基因片段的PCR擴增

2.3 病毒變異分析 根據VP2蛋白6個重要信息氨基酸殘基（297，300，305，324，426和440）的變異分析，11個分離株中1株（SZ1303）為CPV-2，1株（YZ10-4）為CPV-2b，其余9株均為CPV-2a型，沒有分離到CPV-2c。說明江蘇地區犬細小病毒以CPV-2a為主要流行病毒型。此外，我們還觀察到有5個CPV-2a/b分離株的VP2氨基酸發生440 Ala變異，1株CPV-2a（YZ0701L）發生300 Ser變異，疫苗毒株F1株與典型的CPV-2毒株的300 Ala不同，為300 Pro。結果見表1。

表1 CPV分離株VP2蛋白氨基酸殘基變異與毒株分型

2.4 遺傳進化分析 繪制的CPV VP2基因進化樹見圖2，大部分江蘇毒株在同1個獨立分支中，可能是地區環境適應的結果。

3 討論

自從1978年世界上首次從病犬中分離到犬細小病毒（CPV-2）以來，該病毒的抗原持續變異，先后出現了CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c。CPV-2a/b/c與CPV-2有數個氨基酸的差異，其中VP2的297Ala的變異是從世界不同地區分離的CPV-2a/b/c共有的[7]；在VP2426位的氨基酸具有特別意義，CPV-2a為426 Asn ，CPV-2b為426 Asp，而CPV-2c為426 Glu，該殘基位于靠近B表位的一主要抗原位點，該變化被認為影響病毒的免疫原性[3，8]。本研究中，在江蘇地區分離了11個毒株，9株是CPV-2a（297Ala，426 Asn），僅1株（YZ10-4）為CPV-2b（297Ala，426 Asp），沒有分離到CPV-2c，說明江蘇地區以CPV-2a流行為主，這與其他地區報道的結果類似[9]，進一步證明在中國流行的CPV以CPV-2a型為主。

圖2 根據VP2基因繪制的CPV進化樹

本研究中，所有的CPV-2a/b分離株VP2均含有324Ile變異，這一變異于2004年左右開始出現，首先在中國和韓國檢測到[9]。因為與324位氨基酸相鄰的323位氨基酸的改變會影響犬轉鐵蛋白受體與配體的結合，從而造成犬細小病毒宿主范圍的改變[9-10]，因此推測324位氨基酸突變很有可能影響到犬細小病毒的宿主范圍。另外，在本研究中，有5個（50%）CPV-2a/b分離株的VP2氨基酸發生440 Ala變異，440氨基酸也位于病毒的主要抗原位點，他的改變可能導致進一步的抗原變異株的出現，近年來相同的變異已經在許多國家的CPV-2a/b發現[7，10]，也出現在CPV-2c毒株中[7]，因此，440 Ala變異的意義應重點關注。

研究表明，CPV-2a/2b宿主范圍的改變可能是由VP2 蛋白的第 87L、300G（Gly）、305Y（Tyr）位氨基酸改變而引起的，我們分離的毒株絕大部分具有300 Gly、305 Tyr特征，但有1株（YZ0701L）發生300 Ser變異，國內其他研究者也發現有這種變異[11]，但這一變異的意義尚不清楚。另外，我國的疫苗毒株F1株與典型的CPV-2毒株的300Ala不同，為300 Pro，以前未見報道。VP2基因進化樹分析表明，大部分江蘇毒株在同1個獨立分支中，可能是地區環境適應的結果。

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