C-fos對體外培養仔豬睪丸間質細胞睪酮分泌的影響

呂雙陽，袁冬梅，許 潔，史亞利，肖 榕，呂朋沙，方志超，鄭小波

（西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶 榮昌 402460）

睪丸間質細胞（interstitialcell）又稱leydig cell，它是合成分泌雄性激素等物質的內分泌細胞，分布于睪丸生精小管間的疏松結締組織中[1]。睪丸間質細胞還具有調節功能，通過自分泌作用影響支持細胞從而間接作用于生殖細胞調節精子的生成[2]。因此，睪丸間質細胞能夠促進和發揮多種生理功能。探討睪丸間質細胞的作用，可以促進對精子發生機制和雄性生殖生理功能的研究。

C-fos是一種核內原癌基因，用免疫組織化學和原位雜交等方法發現在LC有原癌基因C-fos的表達[3]。許多研究已證實LC分泌睪酮伴有某些原癌基因表達的變化，特別是一些即早基因（如C-jun、C-fos等）表達的變化。況海斌，方立異等證實反義C-fos ASODNs能呈劑量相關方式抑制HCG誘導的大鼠間質細胞睪酮的產生，而無義tat ODNs由于與C-fos無同源互補序列，未觀察到類似的作用[4]。Schultz等研究證實，C-fos參與調控生精上皮更新期間生精細胞增殖、分化活動[5]。從文獻中可以看出，國內外的學者對C-fos的早期研究主要集中于體外培養的細胞，近年來轉向體內，并且主要集中在人和鼠睪丸間質細胞睪酮分泌的量和對睪酮合成途徑各關鍵酶的影響上，很少涉及到C-fos對豬及C-fos對睪丸間質細胞睪酮分泌的影響。作者以榮昌仔豬為材料，通過反義核酸技術觀察C-fos對仔豬睪丸間質細胞睪酮分泌的影響，為深入研究雄性睪酮分泌的機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RPMI-1640培養基（GIBCO公司）；胎牛血清（HyClone公司）；HCG、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司）、仔豬睪酮ELISA檢測試劑盒（上海泛柯生化試劑公司）。C-fos ASODNs稀釋：稀釋前12000 r/min（4℃）離心5 min，使C-fos ASODNs聚集至管底，小心開啟管蓋，加入適量稀釋液，并蓋好管蓋，于漩渦混合器上使其充分溶解，稀釋濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2μmol/L，分裝并-20℃保存。

1.2 試驗動物 健康3周齡的榮昌公豬。

1.3 試驗方法

1.3.1 C-fos ASODNs的合成 通過對榮昌仔豬C-fos基因序列的擴增，選取高度親和力、基于mRNA高級結構模擬、自由能計算合理、基因組中無同源性序列按要求設計C-fos ASODNs及無義核酸。然后由TaKaRa公司合成，分別對首位3個堿基進行硫代磷酸化修飾。引物序列如下：

反義寡核苷酸：5′-CGGTGAGTGGTAGTAGGA GAGA-3′，無義核酸：5′-GTGTCGGTAGGACTGTG?GTATG-3′。

1.3.2 仔豬睪丸間質細胞的分離和培養 無菌條件下采集3周齡的仔豬睪丸，放入冰浴的PBS中（PBS中抗生素濃度加倍），盡快送回實驗室。首先用酒精棉球對睪丸表面進行消毒，并置于滅菌平皿中，然后用PBS和雙抗清洗睪丸，重復3次，用眼科剪、眼科鑷去除睪丸表面結締組織，剝去被膜和鞘膜。再將睪丸移入另一個滅菌平皿中，用不完全培養基清洗3遍，并將睪丸組織剪碎至1 mm3的小塊，加入完全培養基，收集組織液，1000 r/min離心5 min，保留沉淀組織并重復3次，將沉淀組織移入燒杯中，加入5 mL不完全培養基和5 mL 0.5 mg/mL膠原酶消化液，37℃消化60 min，收集消化液，用適量完全培養基稀釋后并1000 r/min離心5 min，棄上清，重復2次，向沉淀中加入適量完全培養基，并用移液槍反復吹吸使之均勻散開，然后用200目銅網篩過濾得到單細胞懸液，通過臺盼藍染色觀察細胞活力，3β-HSD酶活性檢測細胞純度。根據計數結果將間質細胞稀釋至所需濃度，37℃，5%CO2，飽和濕度下培養。

1.3.3 不同濃度C-fos ASODNs和無義tatODNs影響基礎狀態下間質細胞睪酮合成 按照1.3.2培養間質細胞。將試驗組培養的細胞分為6組，分別加入不同濃度的C-fos ASODNs，即0、0.125、0.25、0.5、1、2μmol/L，每個處理設3個重復。37℃培養24 h后，培養液離心（1500 r/min離心5 min），收集培養液待測。無義tat ODNs作對照組，處理方法與試驗組相同。

1.3.4 不同濃度C-fos ASODNs在HCG誘導下影響間質細胞睪酮合成 按照1.3.2培養間質細胞。將試驗組培養的細胞分為6組，分別加入50 IU/mL的HCG以及不同濃度的C-fos ASODNs，即0、0.125、0.25、0.5、1、2 mol/L，每個處理設三個重復。37℃培養24 h后，培養液離心（1500 r/min離心5 min），收集培養液待測。對照組無義tat ODNs代替C-fos ASODNs，處理方法與試驗組相同。

1.4 檢測方法 取出酶標板，依照次序對應分別加入50μL的標準品于空白微孔中；分別標記樣品編號，加入50μL樣品于空白微孔中；在標準品孔和樣品孔中加入100μL的酶標記溶液；37℃孵育反應60 min；濃縮洗液與醫用蒸餾水1∶20倍稀釋后清洗酶標板5次，每次靜置10 s～20 s；每孔加入底物A、B液各50μL；37℃下避光孵育反應15 min；每孔加入50μL終止液，終止反應。在波長450 nm的酶標儀上測定OD值，通過標準曲線得出睪酮濃度值（相關系數0.812）。

1.5 統計學分析 采用Excel、SPSS11.5 For Win?dows等統計軟件進行數據分析，組間計量資料的比較采用非配對t檢驗，P＜0.05時有統計學意義。

2 結果

2.1 體外培養仔豬睪丸間質細胞的功能

2.1.1 臺盼藍細胞活性檢測 采用紅細胞計數方法計算無色透明的細胞數量，在倒置顯微鏡下觀察經臺盼藍染色的細胞懸液，活細胞呈無色透明，藍色為死細胞，其存活率為（91.0±4.6）%（n=5）。

2.1.2 3β-HSD細胞純度檢測 在倒置顯微鏡下觀察經3β-HSD染色的細胞懸液，細胞質中含有藍色顆粒細胞即為睪丸間質細胞，間質細胞百分率為（84.9±3.5）%（n=5）。

2.2 不同濃度C-fos ASODNs和無義tat ODNs對基礎狀態下仔豬睪丸間質細胞睪酮分泌的影響 仔豬睪丸間質細胞（1×108細胞/mL）與不同濃度的C-fos ASODNs（0，0.125，0.25，0.5，1，2 μmol/L）在37 ℃條件下共同培養24 h。間質細胞分泌的睪酮隨著C-fos ASODNs濃度的增加而降低，兩者呈明顯的負相關關系（R=-0.611，P＜0.01）。在0.125μmol/L C-fos ASODNs時可顯著抑制睪酮產生（P＜0.01）。隨著C-fos ASODNs濃度增加對睪酮分泌抑制作用增加，呈計量依賴關系。而1μmol/L C-fos ASODNs以后的濃度，睪酮分泌處于相對穩定水平，而無義tat ODNs無此關系（圖1）。

圖1 不同濃度C-fosA S O D Ns與基礎狀態下仔豬睪丸間質細胞睪酮分泌的關系

2.3 不同濃度C-fos ASODNs對HCG誘導仔豬睪丸間質細胞睪酮分泌的影響 通過對仔豬睪丸間質細胞（1×108細胞/mL）、50 IU/mL HCG和不同濃度的C-fos ASODNs（0，0.125，0.25，0.5，1，2 μmol/L）在37℃條件下共同培養24 h，結果顯示睪酮分泌隨著C-fos ASODNs濃度的增加而降低，兩者呈明顯的負相關關系（R=-0.776，P＜0.01），C-fos ASODNs濃度增加對睪酮分泌的抑制作用增強。在0.125μmol/L C-fos ASODNs時可顯著抑制睪酮產生（P＜0.01）。而無義tat ODNs無此關系（P＞0.05）（圖2）。

圖2 C-fosA S O D Ns和HCG誘導仔豬睪丸間質細胞睪酮分泌的關系

3 討論

原癌基因(proto-oncogene)，又稱細胞癌基因，是廣泛存在于細胞基因組的正常成分，常與正常細胞的生長調控直接相關。有資料表明，原癌基因參與性腺功能的調控[6]。c-fos原癌基因屬于myc家族，在促進性腺激素、生長因子等方面有重要作用，能即刻、短暫表達，故被稱為即刻早期反應基因[7]。

睪丸間質細胞主要功能是分泌睪酮，分泌活動受丘腦下部、垂體及自身的調節。動物體內95%左右的睪酮是睪丸間質細胞分泌的。睪酮被運輸到身體各處的靶器官，通過與受體結合發揮重要的生理功能[8]。有文獻表明，C-fos的表達能促進小鼠的睪丸間質細胞分泌睪酮。這種作用是C-fos表達后，其產物與AP-1位點結合，誘導某些晚期基因轉錄，后經過一系列酶的作用，促進睪酮的合成和分泌[4]。在榮昌仔豬的睪酮分泌中，基礎狀態下間質細胞分泌的睪酮隨C-fos ASODNs濃度的增加而降低，而對照組的無義tat ODNs，睪酮的分泌量變化不大。這說明C-fos能促進仔豬睪丸間質細胞睪酮的生成，即C-fos ASODNs濃度增加，睪丸間質細胞抑制增加，睪酮分泌下降。

近年來研究顯示，HCG引起睪丸間質細胞睪酮分泌的同時伴有C-fos原癌基因表達的增強[9]。當HCG濃度為50 IU/mL時，大鼠睪丸間質細胞睪酮的分泌最強，那么在HCG誘導的榮昌仔豬睪酮分泌中作用如何呢？本試驗利用反義核酸技術，以目的基因C-fos序列為藍本，合成反義寡核苷酸與特定的C-fos基因序列形成特異性結合，抑制或封閉該基因的轉錄和表達，使其喪失功能，因而研究原癌基因C-fos對HCG誘導仔豬間質細胞睪酮生成的影響。結果發現，C-fos ASODNs呈劑量依賴性的抑制HCG誘導的仔豬間質細胞睪酮分泌，在0.125μmol/L C-fos ASODNs時可顯著抑制睪酮產生，而無義tat ODNs無此關系。研究結果顯示，C-fos具有促進HCG誘導的仔豬間質細胞睪酮分泌的作用。

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