合成肽抗原在豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒抗體檢測中的應用

劉博奇，陳善真，陳克宏，羅 均，王志花，王貴平，李其昌

（廣東海大畜牧獸醫研究院，廣東 廣州 511400）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）是由PRRSV直接引發的一種高度接觸性傳染病，其重要流行特征為持續性感染，呈地方流行性。2007年4月，農業部頒布《高致病性豬藍耳病防治技術規范》開始將高致病性藍耳病納入國家重大動物疫病政府強制性免疫范圍。PRRSV的防治和凈化需要安全高效的疫苗以及相關檢測技術的配合使用，因此隨著對藍耳病研究的深入，研制更為精確的抗原用作藍耳病疫苗及相關免疫診斷試劑越來越被重視。

本試驗利用已篩選的PRRSV偶聯多肽為抗原，建立了具有高特異性和敏感度的ELISA方法，為臨床豬血清樣品藍耳病抗體檢測提供了科學有效的快速檢測手段。

1 材料與方法

1.1 試劑 3，5′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB）、聚葡糖糖胺、EDC均為Sigma公司產品；羊抗豬IgGHRP為美國KPL公司產品；PRRS陽性高免血清由廣東永順生物制藥有限公司饋贈；PRRS陰性血清由廣東某實驗動物中心提供。

1.2 多肽的篩選、合成、偶聯 參考已發表文獻，應用生物信息學方法對PRRSV ORF3蛋白的抗原表位進行預測，確認其抗原決定簇（epitopes）篩選出1條針對美洲型抗體位點的PRRS基因序列，由生物公司進行多肽合成及純化。取已合成純化的多肽10 mg溶于50μL DMSO，加入10 mL雙蒸水；稱取1 mg聚葡糖糖胺溶于1 mL PBS中，于多糖溶液內加入10 mg EDC偶聯劑，混勻，最后與多肽溶液混合，室溫下攪拌反正3 h。使用透析袋（MWCO10000-12000）透析6～8 h，除去未結合的偶聯劑及游離多肽，將透析后的液體純化、凍干即得偶聯多肽。

1.3 ELISA操作方法 偶聯多肽用碳酸鹽緩沖溶液稀釋并包被96孔酶標板，100μL/孔，4℃包被過夜。次日取出用PBST洗滌3次，拍干；每孔加入150 μL封閉液，37℃封閉1 h，PBST洗滌3次，拍干，4℃保存備用；用抗體稀釋液稀釋待檢測血清樣品及陰、陽性血清，室溫孵育30 min，PBST洗滌6次，拍干；100μL/孔加入用HRP穩定液1∶4000稀釋的羊抗豬IgG-HRP，室溫孵育30 min，PBST洗滌6次，拍干；每孔加入100μL TMB底物顯色液，室溫避光顯色10min后加入50μL/孔終止液終止反應，于酶標儀測定其OD450nm值。血清樣本抗體效價（S/P）=（OD450nm樣品-OD450nm陰性）/（OD450nm陽性-OD450nm陰性），根據其S/P值確定每份樣品的抗體效價，待測樣品效價大于臨界值的判定為陽性，小于臨界值的判定為陰性。

1.4 ELISA最佳工作條件的確定 以0.125～1μg/mL的偶聯多肽作為抗原包被酶標板，將PRRS陰、陽性血清分別按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80進行稀釋，羊抗豬IgG-HRP二抗做1∶2000、1∶4000、1∶6000、1∶8000四個稀釋度，進行ELISA反應條件優化；分別將陽性和陰性OD450nm值記為S、N，計算S/N值，取S/N值最大且陽性血清OD450nm值接近1.0時各樣品稀釋度為最佳，用以確定抗原濃度、血清稀釋度及HRP的最佳工作濃度。

1.5 陰陽性臨界值的確定 用建立的ELISA方法檢測臨床采集的70份豬藍耳病陰性血清樣品，計算其平均OD450nm值（-X）和標準方差（SD）；根據統計學原則，樣本OD450nm值≥（-X）+2SD時，即可在99.9%的水平上判定為陽性。

1.6 特異性試驗 利用該方法對豬瘟病毒（HCV）、圓環病毒2型（PCV-2）、O型口蹄疫病毒（FMDV）和豬偽狂犬病病毒（PRV）等豬陽性血清樣品進行檢測，觀察該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗 用自建ELISA方法檢測已按1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000系列稀釋的陽性樣品，每個樣品做2個重復孔，并用美國IDEXX豬藍耳病抗體檢測試劑盒做對比參照，用來鑒定該方法的敏感度。

1.8 符合率試驗 用自建ELISA方法對160份已知陰、陽性血清（陰、陽性血清各80份）進行檢測，并與美國IDEXX豬藍耳病抗體檢測試劑盒的檢測結果進行對比分析，計算二者的符合率。

2 結果與分析

2.1 ELISA最佳工作條件 由方陣ELISA測定結果取S/N最大、且陽性血清OD450nm值接近1.0時的濃度為最佳，結果見表1。合成肽抗原最佳包被濃度為0.5μg/mL，血清最佳稀釋度為1∶40，HRP最佳稀釋度為1∶4000。

表1 ELIS A最佳工作條件 （S/N）

2.2 陰、陽性判定的臨界值 對70份陰性豬血清樣本進行檢測，結果見表2。計算其平均OD450nm值（-X）為0.1172，標準方差（SD）為0.0665，計算陰、陽性血清臨界值為-X+2SD=0.2502，因此將0.25判定為血清陰、陽性的界限，即根據血清樣本S/P=（OD450nm值樣品-OD450nm值陰性）/（OD450nm值陽性-OD450nm值陰性）確定每份樣本的抗體效價，當S/P≥0.25時判定為抗體陽性，S/P＜0.25時判定為抗體陰性。

2.3 特異性試驗結果 用自建ELISA方法對豬瘟病毒（HCV）、圓環病毒2型（PCV-2）、O型口蹄疫病毒（FMDV）和豬偽狂犬病病毒（PRV）等豬陽性血清樣品進行檢測，每個樣品重復3個孔，由表3結果可見HCV、PCV-2、FMDV、PRV等陽性血清均不與PRRS多肽抗原發生反應，表明已篩選出的PRRS多肽抗原具有良好的特異性。

表2 陰性血清樣本的OD值

表3 特異性試驗結果

2.4 敏感性試驗結果 用自建ELISA方法對1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000系列稀釋的陽性血清樣品進行檢測，每個樣品做2個重復孔，并用美國IDEXX豬藍耳病抗體檢測試劑盒做對比參照，見表4結果可知，陽性血清稀釋度為1∶1000時仍可檢測出PRRS抗體陽性，表明本抗體檢測試劑盒的最低檢測限量為1∶1000，同時用IDEXX試劑盒在陽性血清稀釋度為1∶1000時檢測PRRS抗體亦為陽性。

表4 敏感性試驗結果

2.5 符合試驗結果 用自建ELISA方法分別對已知的陰、陽性血清各80份進行檢測并與IDEXX檢測結果進行對比：IDEXX檢測血清呈陽性為80份、陰性80份，與已知陰、陽性結果相符；自建多肽檢測血清呈陽性為84份、陰性76份，其中與IDEXX同為陽性73份、陰性69份，假陽性11份、假陰性7份。二者的總體符合率為88.75%。

3 討論

近年來伴隨著政府對于扶持養豬業出臺的一系列政策，規模化豬場的數量也越來越多，對高致病性藍耳病的防治尤為關鍵，在做好計劃免疫的同時，也要定期對豬群進行PRRSV抗體檢測，以便及時了解豬藍耳病的活躍情況及免疫情況。目前對于PRRSV抗體的檢測有多種方法，其中，ELISA方法具有操作簡便、快速、敏感且標準化，尤其適合用于疫病檢測和流行病學調查研究，因此被廣泛用于臨床血清學抗體的檢測。由于國內常見的豬藍耳病多為美洲型，因此本試驗中，我們通過多肽篩選，最終合成了一條針對美洲型抗體位點的特異性多肽序列，通過偶聯技術將多肽偶聯后作為抗原包被酶標板，經過一系列試驗優化后確定其最佳的抗原包被濃度、一抗及二抗的稀釋度等條件。本試驗對酶標板的選取、ELISA封閉液、抗體稀釋液和底物液的配制均進行了長時間的摸索和研究，使之不僅最大程度的降低了非特異性干擾反應，也保證了其試劑的穩定性；建立的ELISA方法具有很好的檢測敏感度及特異性，與美國IDEXX豬藍耳病抗體試劑盒的符合率試驗可達88.75%。由于進口試劑盒價格昂貴，而通過此方法為轉化一種經濟、敏感、穩定的應用試劑盒打下了重要基礎。

表5 符合率試驗結果

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