犬細小病毒山東分離株VP 2基因的克隆與遺傳變異分析

于永樂，張傳美，張 倩，楊海燕，楊瑞梅，張洪亮，單 虎

（1.青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109；2.山東省黃島出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266555）

犬細小病毒（CPV）是引起幼犬出血性胃腸炎和心肌炎的主要病原體之一。CPV-2最早發現于1978年，1978-2000年間，CPV-2先后發生了3次重要的基因變異，產生了CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c 3種主要的抗原變異體[1]。到目前為止，新型變異株New CPV-2a、New CPV-2b、CPV-2c(a)和CPV-2c（b）已逐步取代了原始毒株在多個國家廣泛流行。在我國，1982年最早報道了此病的發生，此后的30多年伴隨著該病毒的不斷進化和變異。盡管目前為預防該病，疫苗接種工作已在國內普及，但由于毒株不斷變異等原因，該病毒仍然廣泛流行，給我國養犬業帶來極大的損失。

CPV是單股、負鏈、線性DNA病毒，基因組全長5.2kb，包含兩個大開放閱讀框ORF1（編碼結構蛋白VP1和VP2）和ORF2（編碼非結構蛋白NS1和NS2），其中VP2蛋白是主要的衣殼蛋白和病毒保護性抗原蛋白，同時具有自我裝配形成病毒樣顆粒（VLPS）的能力。此外，研究表明，VP2基因某些區域的點突變會對病毒抗原性的差異造成影響[2]。本研究對山東地區分離的12株不同的CPV進行VP2基因擴增，并與國內外流行毒株進行序列比較及遺傳變異分析，構建系統進化樹，確定毒株類型，以便及時了解CPV流行毒株的差異及變異情況，為加強CPV的防治工作和制備有效的疫苗提供理論支持和參考。

1 材料與方法

1.1 材料 12株不同的CPV（命名為SDCP1-12），由青島農業大學山東省預防獸醫學重點實驗室分離鑒定并保存。質粒小量提取試劑盒為美國Omega公司產品；DNAiso Regent、DNA-Marker DL-2000、Taq DNA聚合酶、pMD 18-T Vector，均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA膠回收試劑盒，購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成與VP2基因的擴增 根據GenBank上發表的CPV基因序列（登錄號：KF803643），設計1對擴增VP2全基因的引物，由北京賽百盛基因技術有限公司合成。擴增片段長度為1755 bp。上游：5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTC-3′，下游：5′-TTAA TATAATTTTCTAGGTGC-3′，按照DNAiso Regent說明書提取病毒DNA，以提取12株CPV的DNA為模板進行PCR擴增，反應結束后，PCR產物于1%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。

1.2.2 PCR產物的回收、測序與序列分析 對PCR產物用試劑盒進行膠回收和純化，將目的片段與pMD18-T載體連接，并轉化DH5α感受態細胞，挑菌提取質粒進行PCR鑒定，并將陽性質粒進行序列測定。用DNAStar軟件將12株VP2基因的序列與CPV參考株序列以及國內外流行毒株序列進行比較分析。用MEGA 5.0構建核苷酸系統進化樹。

2 結果

2.1 VP2基因擴增、測序及同源性分析 PCR擴增12株CPV，電泳結果出現與預期1755 bp大小一致的目的條帶。經過序列測定，獲得12株CPV的VP2核苷酸序列。12株分離株（SDCP1-12）之間的核苷酸同源率為98.9%～100.0%，氨基酸同源率為98.8%～100.0%；與7株國外參考株CPV-b、CPV-15、V120、CPV-39、Taichung、V139、V203、56/00相比較,核苷酸同源率為98.8%～99.4%，氨基酸同源率為97.9%～100.0%；與疫苗株Vac1的核苷酸同源率為98.6%～99.0%，氨基酸同源率為97.4%～98.5%。表明各分離株與參考毒株同源率較高，差異小；但與疫苗株同源性相對較低，差異大。

2.2 VP2基因中非同義置換的堿基和氨基酸 將分離株核苷酸序列和氨基酸序列與參考毒株對比，與原始的CPV 2a/2b亞型毒株CPV-15/CPV-39相比，第297位氨基酸發生了Ser→Ala突變，第426位氨基酸發生了Asn→Asp突變，據此判定本次分離株SDCP1-4、SDCP6、SDCP9-11為New CPV-2a亞型，SDCP5、SDCP7、SDCP8、SDCP12為New CPV-2b亞型。所有分離株在87位（Met→Leu）、101位（Ile→Thr）、300位（Ala→Gly）、305位（Asp→Tyr）的突變相一致，這4處氨基酸的替換被認為是區分CPV-2及其變異體的重要依據[3]。此外，SDCP1第321位氨基酸N→D，497位氨基酸Q→L；SDCP5第167位氨基酸N→K，399位氨基酸T→I，549位氨基酸Q→L；SDCP10第551位氨基酸M→V；SDCP11第136位氨基酸L→M，182位氨基酸T→S；SDCP12第380位氨基酸F→C，這9處氨基酸的替換從未被報道，是本次分離株所特有的氨基酸突變。

2.3 系統進化樹分析 對12個分離株與Gen?Bank發表的61個國內外CPV分離株進行比對，構建系統進化樹（圖1）。從圖中可以看出，除了SD?CP4和SDCP6外，其余各分離株聚集形成一個大的分支，與我國臺灣地區、泰國、韓國CPV株關系較近處于一個分支上，而與意大利、美國和越南株進化關系較遠。與國內毒株相比，8個New CPV-2a亞型毒株與吉林、黑龍江、甘肅、北京等地毒株親緣關系較近；4個New CPV-2b亞型毒株與廣東、廣西等地毒株親緣關系較近，這與王凈等[4]研究一致，認為我國長江以北地區主要以CPV-2a流行為主，而廣東、云南、四川等南方地區則以CPV-2b流行為主。值得討論的是除了CPV07-04外，其余所有的山東株與本次分離株在拓撲分類上距離較遠。總體看來，12個分離株并沒有形成獨立的分支。

3 討論

圖1 73株C PV VP 2基因核苷酸系統進化樹

目前，CPV-2及其抗原變異株在世界范圍內廣泛流行，New CPV-2a和New CPV-2b已基本替代了CPV-2a和2b在亞洲主要國家（中國、泰國和韓國）[5]流行，而CPV-2c在歐洲（意大利、德國、西班牙、法國）[6]、北美洲（美國）[7]和南美洲（巴西、阿根廷）[8]的流行比例正逐漸擴大。隨著CPV感染率和致病性持續升高，廣泛的分子流行病學調查極為重要。

CPV-2基因變異主要為集中在VP2基因的非同義置換，通過VP2基因定向漂移產生新抗原變異株[9]。本研究12個分離株VP2氨基酸序列共產生18處非同義突變位點，其中第182位氨基酸T→S替換與2012年四川分離株YAZA4相一致[10]；第267位氨基酸F→Y替換并沒有展示在犬細小病毒的衣殼表面，此位點氨基酸改變可能不會影響病毒的抗原性[11]；第321位N→D和324位Y→I替換在空間位置上恰好臨近323位，先前研究表明，93位（Lys→Asn）和323位（Asp→Asn）突變，使CPV獲得結合犬細胞表面TfR的能力[12]，因此，321和324位氨基酸的突變可能引起CPV宿主范圍的改變；第380位和399位氨基酸位于350-400位B細胞抗原表位區內，其親水性和抗原指數較高，是蛋白潛在跨膜區[13]，此處氨基酸的突變可能會影響病毒的抗原性；第440位Y→I替換在多個國家和地區已有報道，該位點處于三重纖突的頂端，是強陽性選擇位點[14]，此處氨基酸的改變可能促使新型變異株的出現；第136位氨基酸L→M，167位氨基酸N→K，497位氨基酸Q→L，549位氨基酸Q→L，551位氨基酸M→V，這5處突變均未見報道，這種變化是否會引起表型或生物學改變，有待進一步驗證和研究。

進化分析顯示，本次分離株與2005-2008年山東分離株進化關系較遠，與2009年之后的分離到的各亞型毒株（泰國，中國臺灣地區，吉林，黑龍江，甘肅，廣東，廣西等地）親緣關系較近，我們認為造成兩者差異的原因有兩個：一是CPV高的突變速率和持續的選擇壓力迫使新分離毒株產生了不同的遺傳變異；二是山東沿海和國內外貿易及人員來往密切，有將國外毒株帶到國內的可能。然而，具體的進化機制和演變過程還需要進一步研究。本研究對2013年分離到的12株CPV流行毒株進行了VP2基因克隆與遺傳變異分析，8株為New CPV-2a亞型，4株為New CPV-2b亞型，與國內外參考毒株核苷酸和氨基酸同源率在98%以上，且分離株VP2基因及其推導的氨基酸的變異主要以點突變為主，關鍵氨基酸位點未見明顯改變。

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