玻璃化冷凍對(duì)豬卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

周 悅，吳亞輝，盧俊求，蔣 艷，王曉麗

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005）

隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們逐漸意識(shí)到建立卵母細(xì)胞保存庫(kù)的重要性。玻璃化冷凍是一種簡(jiǎn)便快速的冷凍方法，成為低溫生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。冷凍解凍后卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力明顯受損，這與冷凍過程造成卵母細(xì)胞損傷密切相關(guān)。豬卵母細(xì)胞含有大量的脂滴，對(duì)低溫的耐受性差，這給豬卵母細(xì)胞的冷凍造成了很大的困難[1-5]。關(guān)于豬卵母細(xì)胞冷凍保存研究尚處于探索階段，特別是玻璃化冷凍對(duì)豬卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的影響等方面的研究，目前國(guó)內(nèi)報(bào)道較少，本研究利用透射電鏡技術(shù)對(duì)玻璃化冷凍前后的GV期和MII期豬卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了研究，旨在為研究豬卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 卵母細(xì)胞的收集和體外成熟培養(yǎng) 豬卵巢由廣西大學(xué)豬場(chǎng)獲得。卵巢取出后迅速放入35℃～37℃的0.9%NaCl溶液（添加75 mg/L青霉素和50 mg/L鏈霉素）中，1 h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。用18號(hào)針頭的10 mL注射器選取直徑3～8 mm的卵泡抽取卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs），放入10 mL離心管置于39℃恒溫槽中靜置沉淀，待15 min后，棄去上清液，用TCM-199液稀釋沉淀，倒置顯微鏡下?lián)斐霭|(zhì)均勻，有多層卵丘細(xì)胞包裹的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體。成熟液洗3次后的COCs放入39℃，5%CO2和100%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)44 h獲得成熟卵母細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 冷凍液與解凍液的配置 基礎(chǔ)液（HM）：TCM199+20%FCS（胎牛血清）；冷凍平衡液：HM+7.5%（DMSO+EG）；冷凍液：HM+17%（DMSO+EG）+0.4M Su；HM+15%（DMSO+EG）+0.5 mol/L Su；解凍液I：HM+0.5 mol/L Su；解凍液II：HM+0.25 mol/L Su；解凍液Ⅲ：HM。

1.2.2 卵母細(xì)胞的冷凍與解凍 卵母細(xì)胞經(jīng)7.5%μg/mL的CB液孵育15 min后，移入平衡液預(yù)處理3～5min，形態(tài)恢復(fù)正常后，放入冷凍液處理30 s內(nèi)裝入半麥管，直接投入液氮中保存。解凍時(shí)，取出半麥管，快速將含卵母細(xì)胞端浸入已平衡好的解凍液I中5 min，移入解凍液II，解凍液III中分別5 min，洗滌數(shù)次，放入培養(yǎng)箱中恢復(fù)培養(yǎng)待用。

1.2.3 透射電鏡樣品制備 卵母細(xì)胞經(jīng)PBS清洗數(shù)次，2.5%戊二醛4℃條件下固定2 h后，PBS洗滌3次。用2%瓊脂聚集卵母細(xì)胞，鋨酸固定2 h，PBS洗滌3次。梯度乙醇脫水，環(huán)氧丙烷置換，純Epon 812中包埋。顯微鏡下修塊，半薄切片，進(jìn)行定位，超薄切片，200目銅網(wǎng)撈片，干燥，醋酸雙氧鈾-檸檬醋酸雙重染色，透射電鏡下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 每組試驗(yàn)重復(fù)5次，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行X2顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果及分析

2.1 GV期卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 GV期卵母細(xì)胞與透明帶連接緊密，微絨毛（Mv）呈細(xì)長(zhǎng)狀伸入透明帶（ZP）中，長(zhǎng)短不一，皮質(zhì)區(qū)分布大量的線粒體（Mi）（圖1a）。質(zhì)膜下極少見皮質(zhì)顆粒，皮質(zhì)區(qū)還可見大量成簇的長(zhǎng)管狀結(jié)構(gòu)（圖1b）。皮質(zhì)區(qū)散在高爾基體（Ga）及囊泡樣結(jié)構(gòu)（圖1c）。線粒體一般呈圓形，橢圓形，少數(shù)呈不規(guī)則形，大小不規(guī)律，線粒體清晰的雙層膜結(jié)構(gòu)，電子密度較高。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見許多脂滴（LD），可分為兩種，一種為灰色脂滴（GLD），一種為深色脂滴（DLD），且脂肪滴的周圍由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不連續(xù)包裹著，線粒體與脂滴相伴出現(xiàn)（圖1d）。

2.2 MII期卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 MII期卵母細(xì)胞達(dá)到成熟的第一特點(diǎn)排出第一極體，極體的細(xì)胞核包圍大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)使其呈現(xiàn)指紋狀，極體位于透明帶及卵母細(xì)胞之間，與卵母細(xì)胞緊密相連（圖1e）。MII期卵母細(xì)胞達(dá)到成熟的第二特點(diǎn)為排列在質(zhì)膜下的大量的皮質(zhì)顆粒（CG），皮質(zhì)顆粒為黑色圓形顆粒（圖1e）。皮質(zhì)區(qū)微絨毛（Mv）縮短成矮柱狀，線粒體（Mi）散在分布且貼近細(xì)胞膜，呈現(xiàn)向細(xì)胞內(nèi)逐漸增多的趨勢(shì)（圖1f）。透明帶與細(xì)胞間形成較大的卵周隙（PVS）（圖1g）。線粒體呈圓形，內(nèi)膜形成的嵴清晰可見，細(xì)胞內(nèi)部線粒體聚集存在。深色脂滴和灰色脂滴由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成邊界，可觀察到線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴隨脂滴分布，皮質(zhì)區(qū)主要分布深色脂滴，且比灰色脂滴體積要大（圖1h）。

2.3 玻璃化冷凍后GV期卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 玻璃化冷凍后GV期卵母細(xì)胞透明帶、細(xì)胞膜損傷，微絨毛（Mv）消失（圖1i），皮質(zhì)區(qū)有成簇的線粒體（Mi）群，線粒體腫脹，基質(zhì)不均、嵴不明顯（圖1j），脂滴（LD）主要為深色脂滴，包圍脂滴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）不完整、電子密度較高（圖1k），伴隨脂滴有腫脹的線粒體分布。胞質(zhì)內(nèi)溶解為絮狀，有大量空泡，未見高爾基體（Ga）（圖1l）。

2.4 玻璃化冷凍后MII期卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 玻璃化冷凍后MII期卵母細(xì)胞透明帶（ZP）損傷，邊緣不平整，微絨毛、細(xì)胞膜損傷甚至消失（圖1m）。皮質(zhì)顆粒排列在質(zhì)膜下，但數(shù)量減少（圖1n）。皮質(zhì)區(qū)以深色脂滴為主，脂滴外圍包裹的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破損或消失（圖1o）。細(xì)胞內(nèi)部以灰色脂滴為主，但脂滴部分溶解，相互連接（圖1p），脂滴周圍伴隨大量腫脹呈圓形的線粒體，大小不一，線粒體嵴不明顯，有的線粒體電子密度增大（圖1p）。

3 討論

合理選擇冷凍保護(hù)劑，運(yùn)用適當(dāng)?shù)睦鋬龇椒梢杂行岣呃鋬霰Ｗo(hù)作用，減少冷凍損傷。細(xì)胞松弛素B（CB）[6]是一種細(xì)胞骨架穩(wěn)定劑，可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架柔韌性達(dá)到降低卵母細(xì)胞低溫敏感的效果。目前CB已經(jīng)成功應(yīng)用于牛[7]、豬[8]、山羊[9]等多種動(dòng)物的卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)中并起到了積極的保護(hù)作用。對(duì)于豬卵母細(xì)胞的冷凍前處理還有離心去脂，化學(xué)去脂等，但尚未得到一致有效結(jié)果。因此為獲得良好的冷凍效果，本研究采用了CB冷凍前預(yù)處理卵母細(xì)胞。

卵母細(xì)胞中線粒體分布廣泛，容易受到發(fā)育環(huán)境的影響。老年小鼠的MII期卵母細(xì)胞線粒體的異常定位率顯著高于青年小鼠[10]，說明卵母細(xì)胞的后續(xù)發(fā)育能力受線粒體的正確空間定位的支配。戴建軍[11]用羅丹明123對(duì)豬卵母細(xì)胞冷凍后的線粒體進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)線粒體變得模糊粗糙，線粒體嵴減少或者消失，凍融后線粒體的正常率只有50%左右，說明線粒體的損傷是造成卵母細(xì)胞解凍后發(fā)育能力減弱的因素之一。朱淑文等[12]采用平皿-玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬卵母細(xì)胞經(jīng)冷凍后對(duì)線粒體的損傷并不嚴(yán)重，只有少部分線粒體電子致密度下降、體積膨大和嵴消失，顯示平皿-玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞對(duì)線粒體損傷較輕。本研究發(fā)現(xiàn)，半麥管法玻璃化冷凍對(duì)成熟前后的卵母細(xì)胞的線粒體都有嚴(yán)重?fù)p傷，說明不同的冷凍方法和不同的冷凍載體對(duì)線粒體冷凍損傷程度不同。

圖1 玻璃化冷凍對(duì)豬卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

透明帶由少數(shù)幾種糖蛋白組成，是包裹在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞外側(cè)，負(fù)責(zé)調(diào)控和調(diào)節(jié)受精的各個(gè)步驟。因?yàn)榫右冉Y(jié)合到透明帶上，引發(fā)頂體反應(yīng)從而穿透透明帶，才可以與卵質(zhì)膜的特異受體相融合，進(jìn)而正常受精，當(dāng)精質(zhì)膜與卵質(zhì)膜融合后才會(huì)釋放皮質(zhì)顆粒[13]。有研究表明，玻璃化冷凍會(huì)造成透明帶硬化，影響卵母細(xì)胞受精作用[14-15]。張德福[16]用0.5%鏈酶蛋白酶處理胚胎后，發(fā)現(xiàn)透明帶消化雖然沒有提高存活率，但顯著提高了囊胚率。說明凍融后透明帶結(jié)構(gòu)的改變制約了胚胎的發(fā)育能力。凍融后卵母細(xì)胞微絨毛減少，消失可能會(huì)減弱卵母細(xì)胞的發(fā)育能力[17]。而武彩紅[18]的研究卻發(fā)現(xiàn)，用鏈酶蛋白酶消化透明帶的時(shí)間顯著低于新鮮卵母細(xì)胞，并提出冷凍未造成透明帶硬化。但該研究?jī)H對(duì)消化時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并未進(jìn)行發(fā)育能力的研究。

豬的卵母細(xì)胞的特點(diǎn)是含有大量的脂滴，脂滴分為深色脂滴和褐色脂滴兩種，通常脂滴周圍由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包裹。不同動(dòng)物所含脂滴含量有所區(qū)別，豬和狗卵母細(xì)胞內(nèi)所含脂滴較多，鼠類卵母細(xì)胞所含脂滴較少[19]。近年來的研究，也圍繞如何克服脂滴的低溫敏感性而大量展開。陸文昊[20]采用化學(xué)去脂法和離心法處理MII期卵母細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，化學(xué)去脂后的卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍可以獲得較高的卵裂率和囊胚率，化學(xué)去脂對(duì)提高M(jìn)II期卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍效果是有效的。說明脂滴的冷凍損傷是導(dǎo)致卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后發(fā)育能力減弱的因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)凍融后的卵母細(xì)胞脂滴形態(tài)破壞，形成空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與脂滴的聯(lián)系損壞，與上述研究結(jié)果相一致。

卵母細(xì)胞還具有一個(gè)特殊的細(xì)胞器是皮質(zhì)顆粒，當(dāng)卵母細(xì)胞未成熟時(shí)，皮質(zhì)顆粒分泌較少且散在分布于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)卵母細(xì)胞逐漸成熟皮質(zhì)顆粒開始向質(zhì)膜遷移，卵母細(xì)胞達(dá)到成熟后，皮質(zhì)顆粒在質(zhì)膜下呈單層連續(xù)排列。皮質(zhì)顆粒在皮質(zhì)下的單層排列也是卵母細(xì)胞達(dá)到成熟的一大標(biāo)志[13-14]，說明本研究所觀察的MII期卵母細(xì)胞已達(dá)成熟。本研究發(fā)現(xiàn)在冷凍解凍后的卵母細(xì)胞中很少見到皮質(zhì)顆粒，可能是冷凍劑的處理和低溫造成皮質(zhì)顆粒提前釋放，這與Myers等[19]報(bào)道的由于冷凍保護(hù)劑中滲透壓的作用導(dǎo)致皮質(zhì)顆粒發(fā)生胞吐作用及質(zhì)膜的破損基本一致，也與朱淑文等[12]采用平皿-玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞對(duì)皮質(zhì)顆粒影響一致。

[1]朱捷，張忠誠(chéng)，劉澤泉.豬卵母細(xì)胞在玻璃化冷凍液中的培養(yǎng)效果[J].中國(guó)畜牧雜志，1995，31（5）：8-9.

[2]戴建軍，吳彩鳳，張廷宇，等.3種冷凍方法對(duì)豬MII期卵母細(xì)胞線粒體分布和損傷的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，43（10）：1525-1530.

[3]朱淑文，張菁，華修國(guó)，等.玻璃化冷凍對(duì)豬卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2006，24（2）：121-126.

[4]劉躍男，朱虎山，金一，等.冷凍保存對(duì)豬卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及發(fā)育潛力的影響[J].國(guó)外畜牧學(xué)-豬與禽，2007（06）：79-80.

[5]張德福，戴建軍，吳彩鳳，等.豬胚胎玻璃化冷凍保存技術(shù)的優(yōu)化[J].生物工程學(xué)報(bào)，2009，25（7）：1095-1100.

[6]王磊.豬卵母細(xì)胞孤雌激活及玻璃化冷凍的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[7]卞桂華，陳自洪，楊娟，等.細(xì)胞松弛素B(CB)對(duì)水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008（07）：34-36.

[8]劉躍男，金一，方南洙，等.抗凍劑、CB和離心極化對(duì)豬GV期卵母細(xì)胞冷凍效率的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，37（01）：29-33.

[9]劉鳳軍，張玉玲，趙明濤，等.CB處理和胞質(zhì)去除對(duì)山羊孤雌胚體外發(fā)育的影響[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006（05）：31-36.

[10]岳明星，朱士恩，侯云鵬，等.老齡化對(duì)昆明系小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力影響的研究[C].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物繁殖學(xué)分會(huì)第十六屆學(xué)術(shù)研討會(huì)，哈爾濱：2012.

[11]劉海軍，張美佳，侯蓉，等.OPS玻璃化冷凍對(duì)山羊卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，29（3）：9-12.

[12]Carroll J，Depypere H，Matthews C D.Freeze-thaw-induced changes of the zona pellucida explains decreased rates of fertiliza?tion in frozen-thawed mouse oocytes[J].Reprod Fertil，1990，90：547-553.

[13]武彩紅.豬卵母細(xì)胞的超低溫冷凍保存及影響其凍后發(fā)育能力的機(jī)理研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[14]武彩紅，李玲，張斌，等.冷凍對(duì)豬體外成熟卵母細(xì)胞透明帶消化時(shí)間和皮質(zhì)顆粒分布的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（05）：280-281.

[15]邱志芳.牛早期卵母細(xì)胞和成熟前后的超微結(jié)構(gòu)變化[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[16]陸文昊.豬MⅡ期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[17]Loos F.Structural aspects of bovine oocyte maturation in vitro[J].Mol Reprod Dev，1992，31：208.

[18]De Loos F，Van Vliet C，van Maurik P V，et al.Morphology of im?mature bovine oocytes[J].Gamete research，1989，24（2）：197-204.

[19]Myers S P，Lin T T，Pitt R E，et al.Cryobehavior of immature bo?vine oocytes[J].Cryo-Lett，1987，8：260-275.