姜黃素對放療致Lewis肺癌荷瘤小鼠機體損傷的保護作用

錢 程 施 丹 武 寧 程光惠(吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春 30033)

盡管放射治療在腫瘤的治療過程中起到了至關重要的作用，但放射治療過程中不僅殺傷腫瘤細胞，對正常組織細胞也有殺傷作用，并伴隨著產生了神經毒性、腎毒性、骨髓抑制、惡心、嘔吐等不良反應〔1〕。姜黃素是從姜黃屬植物姜黃、郁金、莪術等植物的根莖中提取出來的多元酚，具有多種藥理活性:抗動脈硬化、抗炎、抗氧化、抗凝、抗微生物等〔2～4〕，尤其具有明確的抗腫瘤作用〔5〕。有文獻報道，姜黃素對宮頸癌、肝癌、喉癌等具有放療增敏作用〔6～8〕，但對放療致機體損傷的保護作用鮮有報道。本實驗擬觀察姜黃素對放療致Lewis肺癌荷瘤小鼠機體損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物 C57BL/6純系小鼠由中國醫學科學院實驗動物中心提供，體重18～22 g，雌雄各半，實驗前常規飼養7 d，動物合格證號:SCXK11-00-0006。

1.2 試劑與材料 姜黃素購自Sigma公司，－20℃保存，使用前用0.5%CMC-Na溶液稀釋至所需濃度;Lewis肺癌瘤株由中國醫學科學院提供;Yac-1細胞、CTLL2依賴細胞由吉林大學基礎醫學院免疫教研室提供;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、刀豆蛋白(Con)A購自Sigma公司;RPMI1640培養基購自美國Invitrogen公司;新生小牛血清(FCS)購自杭州四季青生物有限公司;DMSO購自北京北化精細化學品責任有限公司;其他試劑均為國產分析純。

1.3 荷瘤小鼠模型的建立 取傳代Lewis肺癌生長狀態良好的小鼠，在無菌條件下剝離瘤組織，研磨成腫瘤勻漿，PBS洗2遍，以RPMI1640完全培養基制成單細胞懸液，用臺盼藍染色，計數，調整細胞的濃度(1×106±5%)個/0.2 ml。接種于C57BL/6小鼠左腹股溝皮下，0.2 ml/只。接種成功以移植瘤長至直徑5 mm為標準，按體重將荷瘤小鼠隨機分成對照組、放射組、姜黃素組和姜黃素+放射聯合組。

1.4 姜黃素對荷瘤小鼠放療后瘤重及抑瘤率的影響 待腫瘤體積為100 mm3時，對照組和放射組給予等體積0.5%CMC-Na灌胃，姜黃素組灌胃給予姜黃素15 mg/kg，放射組一次性給予20 Gy射線照射，聯合組給予姜黃素15 mg/kg和一次性20 Gy射線照射。照射完畢后繼續飼養，末次給藥后處死小鼠，稱取體重、腫瘤重量及體積，脾及胸腺重量，計算腫瘤生長抑瘤率(IR)。IR(%)=(模型組平均瘤重－給藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

1.5 姜黃素對荷瘤小鼠放療后外周血白細胞及骨髓有核細胞計數的影響 給藥后各組隨機取10只動物(雌雄各半)，腹主動脈采血50 μl注入稀釋液中，用全自動動物血球計數儀測定外周血常規計數。然后剝離左側股骨，以3%醋酸10 ml沖出骨髓細胞，按白細胞計數方法，計算1根骨內的骨髓有核細胞數量。

1.6 姜黃素對荷瘤小鼠放療后T淋巴細胞轉化功能的影響無菌取脾制成單細胞懸液，洗2遍，用含10%FCS的培養基調整脾細胞濃度為1×107個/ml。加入96孔培養板，每孔100 μl，每只鼠3復孔。對照孔每孔加100 μl RPMI1640培養液，ConA 刺激孔每孔加 100 μl ConA(終濃度為 5 μg/ml)，37℃、5%CO2培養48 h，加入 MTT 溶液(5 mg/ml)每孔 10 μl，繼續孵育4 h。吸棄孔內上清液，加入 DMSO 100 μl，振蕩10 min。于570 nm波長處測定吸光度(OD)值，計算刺激指數(SI)。SI=ConA刺激孔OD均值/對照孔OD均值。

1.7 姜黃素對荷瘤小鼠放療后NK細胞活性的影響 取濃度為1×107個/ml脾單細胞懸液，調 AC-1細胞懸液(活性 ＞95%)濃度至5×106個/ml。取96孔培養板，每只鼠設效應細胞:靶細胞(20∶1)孔，加100 μl脾細胞懸液，100 μl YAC-1 細胞懸液;效應細胞對照孔:100 μl脾細胞懸液+100 μl RPMI1640培養液;靶細胞對照孔:100 μl YAC-1懸液+100 μl RPMI1640培養液，均設3復孔，37℃、5%CO2培養24 h，各孔加入 MTT溶液(5 mg/ml)10 μl，繼續培養4 h后棄上清，每孔加入100 μl DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。于570 nm波長處測定吸光度(OD)值。計算NK細胞毒百分率(%)=〔靶細胞對照孔OD值－(效應細胞對照孔OD值－效應細胞OD值)〕/靶細胞對照孔OD值×100%。

1.8 統計學處理 采用SPSS12.0用軟件，計量資料以±s表示，組間差異比較t檢驗。

2 結果

2.1 姜黃素對放射治療小鼠Lewis肺癌的增敏作用 與對照組比較，放射組荷瘤小鼠體重、瘤重及腫瘤體積明顯降低(P＜0.01或P＜0.001);姜黃素亦可使荷瘤小鼠瘤重、腫瘤體積明顯降低(P＜0.01)，腫瘤抑制率為33.78%。聯合應用姜黃素和放射治療可使荷瘤小鼠瘤重、腫瘤體積明顯降低(P＜0.001)，腫瘤抑制率為65.25%。與單獨放射治療比較，聯合應用可對抗放療致荷瘤小鼠體重降低(P＜0.01)，且荷瘤小鼠瘤重、腫瘤體積明顯下降(P＜0.01)，腫瘤抑制率顯著升高(P＜0.001)。見表1。

2.2 姜黃素對放射治療小鼠Lewis肺癌的減毒作用 與對照組比較，放射組在發揮抗腫瘤作用的同時臟器指數、外周血白細胞總數及骨髓有核細胞數均明顯下降(P＜0.01或P＜0.001)。見表1。

表1 各組小鼠體重、瘤重、腫瘤體積、臟器指數、外周血白細胞總數及骨髓有核細胞數比較(±s)

表1 各組小鼠體重、瘤重、腫瘤體積、臟器指數、外周血白細胞總數及骨髓有核細胞數比較(±s)

與對照組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.001;與放射組比較:3)P ＜0.01，4)P ＜0.001

組別 n 體重(g) 瘤重(g) 腫瘤體積(mm3) 胸腺指數 脾指數 白細胞(×109/L)骨髓有核細胞(×106/L)16±0.031 0.423±0.103 11.21±2.39 13.25±4.21放射組 13/11 19.18±2.891) 0.69±0.131)1 896.5±222.31)0.08±0.0232) 0.412±0.085 5.05±2.172) 4.04±1.232)姜黃素組 10/10 20.50±1.79 0.65±0.171)1 716.4±211.61)0.09±0.0212)0.392±0.0811)3)6.96±1.271)3)6.33±2.091)3)姜黃素+放射聯合組 10/10 20.98±2.633)0.37±0.122)3)1 024.9±188.92)3)0.18±0.0273)0.358±0.0661)3)8.87±2.351)4)8.25±1.341)4)對照組 12/12 21.78±2.53 1.09±0.21 2 140.6±289.64 0.

2.3 姜黃素對放射治療小鼠Lewis肺癌T淋巴細胞轉化和NK細胞活性的影響 與對照組比較，放射組ConA誘導的小鼠淋巴細胞增殖反應〔(0.15±0.04)vs(0.22±0.05)〕及小鼠NK細胞活性明顯降低〔(15.17±3.78)%vs(20.15±3.79)%，P＜0.05〕。姜黃素與放射治療合用，可使ConA誘導的小鼠淋巴細胞增殖反應顯著升高〔0.31±0.06，P＜0.05〕，亦可明顯提高小鼠NK細胞活性〔(22.16±2.79)%，P＜0.05〕。姜黃素組SI為0.23±0.06，NK細胞活性為(20.02±3.17)%。

3 討論

應用有效的輔助藥物減輕放療所致的機體損傷已成為腫瘤治療中不可或缺的一部分。在腫瘤末期，患者的免疫缺陷顯得尤為明顯〔9〕。因此，對腫瘤患者來說，提高自身的免疫力是極為重要的。生理狀態下，肺臟含有相對數量多的NK細胞，是重要的、潛在的抗腫瘤效應器〔10〕，在治療肺癌的過程中，研究NK細胞和T淋巴細胞的轉化功能具有重要的意義。實驗結果表明姜黃素與放療聯合應用能明顯提高荷瘤小鼠的腫瘤抑制率，縮小腫瘤的體積，與放療協同發揮抗腫瘤作用;姜黃素與放療聯合應用可減輕單獨放療所致的骨髓抑制、外周血白細胞水平降低、免疫器官萎縮，對放療有減毒增效的作用;姜黃素與放療聯合應用比單獨應用放療對NK細胞活性及T淋巴細胞轉化功能作用明顯，可使NK細胞活性及T淋巴細胞轉化功能均顯著提高，提示姜黃素能增強荷瘤小鼠的免疫力。綜上所述，姜黃素對放療致荷瘤小鼠機體損傷具有保護作用，其機制可能與抗貧血、升高白細胞及免疫調節作用有關。

1 趙昌林，程少冰，李恒謀.惡性腫瘤放化療對機體損傷的病因病機分析〔J〕.山東中醫雜志，2010;30(1):22-3.

2 Li M，Wu Z，Niu W，et al.The protective effect of curcumin against the 19-kDa mycobacterium tuberculosis protein-induced inflammation and apoptosis in human macrophages〔J〕.Mol Med Rep，2014;10(6):3261-7.

3 Ahmed HH，Shousha WG，Shalby AB，et al.Curcumin:a unique antioxidant offers a multimechanistic approach for management of hepatocellular carcinoma in rat model〔J〕.Tumour Biol，2014:〔Epub ahead of print〕.

4 Vukic＇evic＇M，Hegge AB，Vulic＇P，et al.Poloxamer-based curcumin solid dispersions for extempore preparation of supersaturated solutions intended for antimicrobial photodynamic therapy〔J〕.Pharm Dev Technol，2014;19(1):1-9.

5 Yoysungnoen-Chintana P，Bhattarakosol P，Patumraj S.Antitumor and anti-angiogenic activities of curcumin in cervical cancer xenografts in nude mice〔J〕.Biomed Res Int，2014;2014:817972.

6 鄧懷慈，韓蘇夏，陳 謙.姜黃素對人宮頸癌Hela細胞放射敏感性影響的實驗研究〔J〕.陜西醫學雜志，2004;5:393-4.

7 王偉章，張碧魚，陳宏遠，等.姜黃素對人肝癌細胞Sk-hep-1抗癌作用的研究〔J〕.中國中藥雜志，2010;4:485-8.

8 曹彥洋，劉偉琦.姜黃素對人喉癌Hep-2細胞放療敏感性的實驗研究〔J〕.中醫臨床研究，2013;16:3-6.

9 Doyen J，Benezery K，Follana P，et al.Predictive factors for early and late local toxicities in anal cancer treated by radiotherapy in combination with or without chemotherapy〔J〕.Dis Colon Rectum，2013;56(10):1125-33.

10 Kanegasaki S，Matsushima K，Shiraishi K，et al.Macrophage inflammatory protein derivative ECI301 enhances the alarmin-associated abscopal benefits of tumor radiotherapy〔J〕.Cancer Res，2014;74(18):5070-8.