Rho激酶信號通路與大鼠心肌細胞凋亡的關系

陳 華 呂妍琨 齊 鵬 杜榮品 谷 劍 陳淑霞 耿彥平 李 燕 于 芳

(河北省人民醫院心臟中心，河北 石家莊 050051)

急性心肌梗死患者多因冠狀脈粥樣硬化起病，而后因過勞、激動、暴飲暴食、便秘、寒熱刺激、吸煙、酗酒等導致斑塊破裂，進而阻塞冠狀動脈管腔，誘發心肌缺血、缺氧性壞死〔1〕。心肌梗死患者臨床癥狀有出汗、煩躁、惡心、嘔吐、心絞痛、休克、心力衰竭等。研究顯示，心肌缺血、缺氧性壞死是一個多種細胞因子、多途徑共同作用的結果〔2〕。Rho激酶是膠原交聯羧基末端肽(CTP)結合蛋白的重要效應分子，可通過Rho激酶信號通路參與多種細胞的生理功能。本文擬分析Rho激酶信號通路在心肌梗死模型大鼠心肌細胞凋亡組織中的表達變化及對心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 50只健康雄性Wistar大鼠，體質量245～285 g，平均(262.8±18.5)g，均購買自某大學動物實驗中心(動物許可證編號:SCX20040018);隨機選取15只作為假手術組，其余35只進行心肌梗死造模成功后隨機分為治療組和模型組各15只(造模中死亡2只，剩余3只棄用)。均自由進食進水，光照時間12 h，室溫23～25℃，平均濕度(55±5)%的環境中。

1.2 實驗儀器與藥品 選用杭州博日生物工程有限公司生產的RNA抽提試劑盒、T-PCR試劑盒;選用天津紅同藥業股份有限公司生產的法舒地爾;選用武漢博士德生物工程有限公司生產的ABC免疫組化試劑盒、抗Bax及抗Bcl-2抗體。選用成都泰盟科技有限公司生產的L-420E+生物機能實驗系統;選用M3 Reserch Inc PUC-IOOUM PCR擴增儀;選用上海醫用恒溫設備廠生產的FX-DY-252型電泳儀、電熱恒溫水槽。

1.3 造模及治療方法 腹腔水合氯醛麻醉大鼠，固定于手術臺，去除胸部、頸部毛發，消毒，切開頸部皮膚，暴露氣管及甲狀腺，于甲狀腺后方鈍性分離氣管，需注意不損傷甲狀腺及血管。剪開氣管環，行氣管插管操作，連接呼吸機。剪開胸部皮膚，暴露肌肉組織，分離胸大肌、前鋸肌，顯露肋骨，打開胸膜，進入胸腔，探查大鼠左心耳位置，于左心耳下方2 cm處進針，縫扎左心耳及肺動脈圓錐交接處及靜脈。觀察心電圖，如ST段抬高，同時結扎線下心肌顏色變淡，即表明造模成功。逐步縫合胸腔及頸部切口，常規抗感染治療，放回飼養籠。治療組大鼠行5 mg/kg胸腔法舒地爾給藥，2次/d，持續4 w。另兩組等量生理鹽水處理。

1.4 心肌梗死面積測定 4 w后腹腔麻醉大鼠，切開大鼠頸部皮膚，暴露右側頸動脈。游離大鼠右側頸動脈，結扎遠心端，動脈夾夾閉近心端，留置靜脈管，連接血壓換能器，檢測大鼠左心室收縮壓(LVSP)、左室舒張壓(LVEDP)、左室內壓最大上升和下降速率(+dp/dtmax、-dp/dtmax)。

1.5 指標檢測方法 心肌梗死面積測定后處死大鼠，取出心臟，用生理鹽水漂洗，剪出梗死周邊區心肌組織，將其中一部分組織甲醛固定，另一部分存儲于－70℃溫箱內待用。根據RNA抽提試劑盒說明書提取總RNA，使用RT反應試劑盒進行cDNA轉錄操作，PCR擴增，引物序列由上海生工生物工程股份有限公司提供，電泳擴增產物，選用經凝膠成像系統分析樣本Rho激酶mRNA、Bax蛋白及Bcl-2蛋白表達情況。

1.6 觀察指標 觀察4 w后的血流動力學指標:LVSP、LVEDP、+dp/dtmax，-dp/dtmax;模型組和治療組心肌缺血面積、心梗面積測定值;3組心肌組織中Rho激酶mRNA、Bax及Bcl-2蛋白的表達情況。

1.7 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，計量資料采用t檢驗。

2 結果

2.1 3組血流動力學指標差異 模型組LVSP、+dp/dtmax、－dp/dtmax顯著低于治療組和假手術組(P＜0.05)，LVEDP顯著高于治療組和假手術組(P＜0.05)，治療組LVSP、+dp/dtmax、－dp/dtmax顯著低于假手術組(P＜0.05)，LVEDP顯著高于假手術組(P＜0.05)。見表1。

表1 3組血流動力學指標比較(±s，kPa，n=15)

表1 3組血流動力學指標比較(±s，kPa，n=15)

與假手術組比較:1)P＜0.05;與治療組比較:2)P＜0.05;下表同

LVSP LVEDP +dp/dtmax -dp/dtmax假手術組 20.6±0.62 －1.26±0.32 1 102.5±230.6 －1 098.6±組別218.9模型組 15.3±0.591)2)0.36±0.611)2)683.9±172.51)2)－681.5±162.41)2)治療組 16.8±0.721) －0.64±0.421)883.5±135.41)－856.2±141.51)F值 28.253 13.698 8.624 7.182 P值 ＜0.001 0.002 0.026 0.032

2.2 治療組和模型組心肌缺血面積、心肌梗死面積百分比值治療組心肌缺血面積〔(33.6±2.8)%〕低于模型組〔(35.5±3.2)%〕，但差異不顯著(t=1.731，P=0.082);治療組心梗面積〔(29.3±2.7)%〕顯著低于模型組〔(32.6±2.9)%〕(t=3.226，P=0.004)。

2.3 3組心肌的Rho激酶mRNA、Bax蛋白、Bcl-2蛋白表達差異 3組Rho激酶mRNA、Bax蛋白、Bcl-2蛋白表達差異有統計學意義(P＜0.05);組間均具有顯著差異(P＜0.05)。見表2。

表2 3組心肌組織Rho激酶mRNA、Bax蛋白、Bcl-2蛋白表達差異(±s，n=15)

表2 3組心肌組織Rho激酶mRNA、Bax蛋白、Bcl-2蛋白表達差異(±s，n=15)

蛋白假手術組組別 Rho激酶mRNA Bax蛋白 Bcl-2 0.41±0.06 0.38±0.29 1.26±0.43治療組 0.28±0.061)2) 0.72±0.251)2) 1.74±0.411)2)模型組 0.48±0.041) 1.08±0.321) 0.63±0.381)F/P值10.742/0.002 8.288/0.026 9.690/0.018

3 討論

急性心肌梗死發病后患者將出現大規模的心肌細胞壞死情況，此時患者心肌功能將大幅下降，梗死及周圍心肌收縮乏力，心肌總收縮力降低，+dp/dtmax，-dp/dtmax下降，LVSP下降，心肌泵血能力也隨之降低，最終導致每搏輸出量減少，心室射血后余量降格，誘使LVEDP升高〔3〕。為保證心臟正常工作，未梗死區域心肌組織需對梗死區域進行代償收縮，并出現心肌肥大、心室重構情況。心室重構是急性心肌梗死發病后的一種代償反應，當代償超過一定程度時，患者將合并心功能不全癥狀，最終發展為心力衰竭，危及生命〔4〕。本研究提示急性心肌梗死大鼠心臟收縮、舒張能力嚴重損傷，而有效的治療介入可改善大鼠心臟功能。

心肌細胞凋亡是Rho激酶、Bax蛋白等多種細胞因子共同作用結果。Rho激酶是絲氨酸/氨酸蛋白激酶，分子量為160 kD〔5〕。Rho激酶C末端區域具有激酶負性調控作用，靜息狀態下，Rho激酶C末端可通過折返或催化來抑制Rho蛋白結合結構域(RBD)、ATP活性，并誘使下游信號無法與底物相互結合。Rho激酶具有介導黏著斑、整合素活性，并參與細胞生存的功能，抑制Rho激酶可損傷細胞骨架內的肌動蛋白絲的完整性進而誘發細胞凋亡〔6〕。Rho激酶還可抑制Bcl-2活性，降低炎癥反應，進而降低細胞凋亡率，這表明Rho激酶可通過降低Bcl-2活性來參與細胞凋亡過程，是心血管疾病發生、發展的重要參與因子。B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)是原癌基因的一種，其可抵抗多種細胞毒素作用，增強DNA損傷因子的抵抗性，最終抑制細胞凋亡〔7〕。Bax基因是Bcl-2基因家族的一員，廣泛存在于肝、腎、呼吸系統及血管平滑肌細胞內，可與Bcl-2組成異二聚體，并抑制Bcl-2活性〔8〕。Bax蛋白是生物體重要的促細胞凋亡因子，已有研究顯示，創傷失血性大鼠存在明顯Bax蛋白高表達情況。Bax/Bcl-2蛋白比例是細胞凋亡抑制作用強弱的重要影響因子〔9〕。本研究提示法舒地爾具有抑制Rho激酶活性，調節Bcl-2蛋白表達，抑制細胞凋亡的作用。法舒地爾是一種具有廣泛藥理作用的新型藥劑，可通過ATP競爭Rho激酶催化區的ATP位點，進而抑制Rho激酶mRNA的自表達〔10〕。

綜上，Rho激酶mRNA、Bax蛋白、Bcl-2蛋白是心肌細胞凋亡的重要參與因子，其中Rho激酶mRNA、Bax蛋白具有促細胞凋亡作用，而Bcl-2蛋白具有抑制細胞凋亡的作用。而法舒地爾用藥后大鼠Rho激酶mRNA表達顯著降低，進而降低心肌細胞凋亡率，減輕心肌梗死面積。

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