白細胞介素18基因工程表達方法

喬友軍 汪 欣 高 杰 王 寶 賈春祎 (吉林大學第一醫(yī)院，吉林 長春 3006)

白細胞介素(IL)-18是一種新型具有多態(tài)性的免疫細胞調節(jié)因子，以前稱干擾素(IFN)-γ誘導因子〔1〕。IL-18具有抗多種病毒、抗細菌、真菌的功能〔2〕;其對T細胞、B細胞免疫及NK細胞免疫均有相應的生物學作用。IL-18可直接誘導NK細胞和單核細胞分泌 IFN-γ〔3〕，IFN-γ 不抑制 B 細胞的分泌，但可抑制B細胞生成IgE、IgG，對IgG2d高表達〔4〕。IL-18通過增進分泌IL-10，使腫瘤細胞對NK細胞的敏感性增加〔5〕，從而增強對腫瘤細胞的殺傷力。當NK細胞與腫瘤靶細胞結合后開始相互作用，隨即啟動細胞死亡信號，最終細胞DNA的斷裂致使細胞凋亡，起到抗腫瘤的作用。

1 資料與方法

1.1 主要試劑儀器 DNA MARKER:寶生物工程(大連)有限公司;質粒DNA提取試劑盒:天根生化科技有限公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱:GSP-9270型，上海博迅實業(yè)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 含有pGEX-IL-18重組體質粒的E.coli JM109菌復蘇－80℃冰箱取E.coli JM109菌凍存管1支，立即放入37℃水浴箱中，待完全融化后在生物安全柜內以無菌程序將JM109菌液接種于50 ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃，230 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，觀察菌液生長情況，供質粒提取使用。

1.2.2 質粒提取 柱平衡后，集菌5 ml，12 000 r/min離心1 min，吸棄上清液。向離心管中加入P1 250 μl，用渦旋振蕩器徹底使細菌沉淀懸浮。向離心管中加入P2 250 μl，顛倒混勻6次。向離心管中加入 P3 350 μl后，顛倒混勻 6次，再12 000 r/min離心10 min后會有沉淀形成。收集上清轉移到吸附柱CP3中，12 000 r/min離心40 s，倒掉廢液。向吸附柱CP3中加入漂洗液PW 600 μl，再12 000 r/min離心40 s，倒掉廢液。先將吸附柱CP3放入收集管中，再12 000 r/min離心2 min。向吸附膜的中間滴加洗脫緩沖液EB 60 μl，室溫放置2 min，12 000 r/min離心2 min，將質粒溶液收集到離心管中備用。該質粒為pGEX-IL-18，并經過測序和基因庫比對證實。

1.2.3 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的質粒 配制1%瓊脂糖凝膠后，放入電泳槽中。將樣品與6×DNA上樣緩沖液混合，并將樣品混合液反復吹打混和均勻，加入到凝膠的加樣孔內，再加入 DNA Marker 2 μl。電泳儀開啟，電壓 100 V，電流90 mA，時間為30 min，最后進行瓊脂糖凝膠電泳。用凝膠成像儀觀察照相。

1.2.4 轉化 將質粒轉化到DH5α細菌內，制備表達IL-18的細胞。組質粒 pGEX-IL-18具備表達 IL-18的功能，轉化到DH5α細菌內，進行增菌培養(yǎng)，即可得到表達的IL-18。

1.2.4.1 受體菌的培養(yǎng) 將甘油貯存的受體菌DH5α在LB平板上劃線，37℃培養(yǎng)20 h。挑取2 mm大小的單菌落接種于1 ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖過夜。取上述菌液200 μl轉入50 ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 300 r/min，振蕩培養(yǎng)2.5 h，使細胞的濃度達5×107個/ml，此時細菌的OD260一般在0.2～0.4之間。

1.2.4.2 感受態(tài)細胞的制備 將培養(yǎng)的菌液冰上放置10 min，然后轉移離心管中，4℃ 4 000 r/min離心10 min，棄上清，將離心管倒置于吸水紙上，使剩余的液體流盡。加入10 ml預冷的0.1 mol/L CaCl2使沉淀輕輕懸浮，然后冰浴15 min。此時為感受態(tài)細胞。將上述菌液4℃ 4 000 r/min離心10 min，棄上清，每50 ml的原培養(yǎng)物加入2 ml冰預冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，再加終濃度為10%的滅菌甘油，按每份200 μl分裝在Ep管中，置－70℃凍貯。

1.2.4.3 質粒轉化到宿主菌細胞內 把感受態(tài)細胞各200 μl分別加入實驗管、陽性管、陰性管中;連接產物(100～500)加入實驗管10 μl;已知質粒DNA(10)加入陽性管10 μl;無菌水加入陰性管10 μl后42℃ 90 s后迅速置冰浴3～5 min;再分別在實驗管、陽性管、陰性管中加入SOC培養(yǎng)基各800 μl;37℃振搖培養(yǎng)45～90 min。

1.2.4.4 藍白篩選陽性重組體 取含100 μg/ml氨芐青霉素的LB平板，在板面上涂布IPTG試劑和X-gal試劑。將200 μl上述培養(yǎng)物，以玻璃涂布棒輕輕地平鋪于瓊脂平板表面。將平板置于室溫下至液體被完全吸收，倒置平皿，37℃過夜培養(yǎng)。觀察藍白菌落，白色為陽性重組體。

2 結果

質粒提取瓊脂糖凝膠檢測結果質粒大小為2.7 kb，見圖1。測序結果為IL-18基因片段，見圖2。重組體插入基因片段生物信息比對顯示，插入片段長度和順序與目的基因相符，見圖3。藍白篩選與抗性篩選一同使用，篩選結果:未轉化的菌不具有抗性，不生長;轉化了空載體，即未重組質粒的菌，長成藍色菌落;轉化了重組質粒的菌，即目的重組菌，長成白色菌落。

圖1 pGEX-IL-18重組體質粒電泳結果

圖2 IL-18基因片段測序結果

圖3 重組體插入基因片段生物信息比對截圖

3 討論

IL-18是腫瘤免疫學研究的熱點。隨著研究的深入，發(fā)現它實為免疫調節(jié)因子可殺傷或抑制腫瘤生長并在腫瘤免疫方面發(fā)揮了極其重要的作用。很多學者發(fā)現腫瘤患者IL-18水平在有轉移患者比無轉移患者和對照組有顯著性增高，從而說明IL-18水平的變化可能反映了人體對腫瘤細胞的防御程度。IL-18對免疫細胞有多項免疫調節(jié)功能，這個細胞因子極大潛在的抗腫瘤能力。因此IL-18在腫瘤基因治療方面具有潛在的發(fā)展空間，其在基礎領域和應用領域都有了嶄新的發(fā)展。如何利用基因工程表達來制備IL-18將是未來的趨勢。

本研究探討了基因工程制備IL-18的實驗條件，為制備IL-18提供實驗保障。下一步工作將是制備純化IL-18的實驗研究，將這個質粒重組體轉移到具有高效表達功能的DH5α宿主菌中進行目的蛋白表達實驗研究，同時探討可通過GST標簽親和層析純化目的蛋白的條件。基于IL-18具有重要抗腫瘤等多種的生物學功能，將對IL-18進行后續(xù)的科研工作系統(tǒng)研究。

1 Nakamura K，Okamura H，Nagata K，et al.Purification of a factor which provides a costimulatory signal for gamma int erferon production〔J〕.Infect Immun，1993;61(1):64.

2 Zhang T，Kawakami K，Qureshi MH，et al.Inteleukin-12(IL-12)and IL-18 synergistrically induce the fungicidal activity of murine peritoneal exudate cells against cryptococcus neoformans through production of gamma interferon by natural killer cells〔J〕.Infect Immunol，1997;65(9):3594-9.

3 Greene CM，Meachery G，Taggart C，et al.Role of IL-18 in CD4 T lymphocyte activation in Sarcoidosis〔J〕.J Immunol，2000;165(8):4718-24.

4 Born TL，Morrison LA，Esteban DJ，et al.A poxvirus protein that binds toand inactivates IL-18 and inhibit s NK cell response〔J〕.J Immunol，2000;164(6):3246-54.

5 Cardon GE，Lindemann MJ，Baiocchi R，et al.The functional characterization of interlukin-10 receptor expression on human natural killer cells〔J〕.Blood，1995;8512:3577-85.