易腦卒中型腎血管型高血壓大鼠血漿中一氧化氮、腫瘤壞死因子-α及C反應蛋白含量在高血壓進程中的動態變化

何國英 張美云 (天津市人民醫院神經內科，天津 300120)

臨床研究發現，高血壓是腦卒中的獨立危險因素，該類患者腦出血率、死亡率顯著高于其他類型腦卒中患者〔1〕。但高血壓誘發腦卒中的發病機制臨床尚無確切結論，分析可能與超敏C反應蛋白(hs-CRP)、一氧化氮(NO)及腫瘤壞死因子(TNF)-α等多種細胞因子共同作用有關〔2〕。為分析 hs-CRP、NO、TNF-α在高血壓型腦卒中的表達情況及臨床價值，本文選用健康雄性SD大鼠進行雙腎雙夾法造腎血管型高血壓大鼠(RHRSP)模型研究。雙腎雙夾法造RHRSP模型是一種血壓上升穩定，存在血管閉塞、纖維素樣壞死、微動脈瘤生成等多種病理改變的造模方法，與高血壓型腦卒中具有極高相似度。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、分組及試劑與藥品 健康雄性SD大鼠36只進行1～36數字編號，體重80～120 g，平均(98.4±9.2)g;由復旦大學醫學部動物實驗中心提供，動物許可證編號:HA20140018，喂養于室溫25℃，自由進食進水的環境中。再隨機分為研究組和對照組各18只，研究組采用雙腎雙夾法造RHRSP模型，對照組采用假手術方法(不上銀夾)。選用深圳晶美生物工程有限公司生產的大鼠血清TNF-α ELISA試劑盒;選用上海藍季科技發展有限公司生產的蘇木精;選用武漢博士德生物工程有限公司生產的多聚賴氨酸;選用南京建成生物工程研究所提供的NO試劑盒。選用中山大學神經病學研究所提供的0.4 mm環形銀夾;選用中南大學湘雅醫學院提供的鼠尾測壓儀;選用美國Bio-Tek ELX808型酶標儀;選用上海第三分析儀器廠生產的721可見光分光光度計。

1.2 雙腎雙夾RHRSP模型制作 選用水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹部正中切口，分離雙側腎動脈，于腎動脈起始位置鉗夾0.4 mm內徑銀夾，觀察腎臟有無血瘀、壞死及蒼白情況，如無則逐步縫合腹膜、肌肉、皮膚，術后常規抗感染治療。于術后6 h恢復喂食。對照組采用假手術方法，操作同上但不上銀夾。

1.3 收縮壓(SBP)、舌下靜脈血NO、CRP及TNF-α的測定方法 術前于37℃恒溫下預熱鼠尾測壓儀后檢測大鼠尾動脈SBP，檢測 3 次，取平均值，術后第 1、2、4、8、12、16 周再行尾動脈SBP檢測操作。術后血壓≥150 mmHg判定為高血壓大鼠。于術前、術后第 1、2、4、8、12、16 周各取大鼠舌下靜脈血 1ml，離心，存儲于－80℃待用。最后一次取血后處死大鼠，常規腦灌注取腦，腦組織行HE染色，以觀察腦動脈硬化情況。用硝酸還原酶法檢測大鼠血清NO值。選用雙抗體夾心ELISA法檢測血清CRP、TNF-α值，于酶標儀450nm處檢測OD值，結果導入curve expert1.3軟件處理。計算最終CRP、TNF-α含量。

1.4 統計學方法 應用SPSS17.0統計學軟件對數據的組間比較進行t檢驗。

2 結果

2.1 兩組SBP變化情況 術前兩組SBP測定值差異無統計學意義(P ＞0.05)，術后第 1、2、4、8、12、16 周研究組 SBP 值顯著高于對照組(P＜0.05)，且呈現出明顯的上升趨勢，與術前比較顯著增高(P＜0.05)。見表1。

2.2 兩組hs-CRP變化情況 術前兩組CRP測定值差異無統計學意義(P ＞0.05)，術后第 1、2、4、8、12、16 周研究組 hs-CRP值顯著高于對照組(P＜0.05)，且呈現出明顯的上升趨勢，與術前比較顯著增高(P＜0.05)。見表2。

2.3 兩組NO變化情況 術前兩組NO測定值差異無統計學意義(P ＞0.05)，術后第 1、2、4、8、12、16 周兩組 NO 值差異顯著(P ＜0.05)，研究組呈現出明顯的上升趨勢，在術后第2周達到最高值后逐漸下降，與術前比較差異顯著(P＜0.05)。見表3。

2.4 兩組TNF-α變化情況 術前兩組TNF-α測定值差異無統計學意義(P ＞0.05)，術后第 1、2、4、8、12、16 周研究組 TNF-α值顯著高于對照組(P＜0.05)，且呈現出明顯的上升趨勢，與術前比較顯著增高(P＜0.05)。見表4。

表1 兩組SBP變化情況(±s，mmHg)

表1 兩組SBP變化情況(±s，mmHg)

與術前比較:1)P＜0.05，下表同

組別 n 術前 第1周 第2周 第4周 第8周 第12周 第16周對照組 17 103.6±8.2 105.6±7.9 106.2±8.1 108.3±7.6 107.2±8.5 108.6±8.4 108.9±11.3研究組 16 101.9±7.1 134.3±9.51) 151.3±11.21) 172.5±12.61) 193.4±16.81) 215.8±21.71) 249.7±33.61)t/P值 0.635/0.453 9.459/＜0.001 13.315/＜0.001 17.849/＜0.001 18.769/＜0.001 18.932/＜0.001 16.338/＜0.001

表2 兩組hs-CRP變化情況(±s，mg/L)

表2 兩組hs-CRP變化情況(±s，mg/L)

組別 n 術前 第1周 第2周 第4周 第8周 第12周 第16周對照組 17 0.29±0.09 0.31±0.08 0.30±0.07 0.32±0.09 0.32±0.08 0.33±0.10 0.32±0.09研究組 16 0.28±0.09 0.38±0.101) 0.44±0.121) 0.62±0.171) 0.83±0.251) 0.97±0.291) 1.08±0.311)t/P值 0.319/0.724 2.227/0.028 4.124/＜0.001 6.391/＜0.001 7.994/＜0.001 8.936/＜0.001 10.258/＜0.001

表3 兩組NO變化情況(±s，μmol/L)

表3 兩組NO變化情況(±s，μmol/L)

組別 n 術前 第1周 第2周 第4周 第8周 第12周 第16周對照組 17 33.1±4.5 33.6±4.7 33.7±4.3 32.4±3.8 34.1±3.9 30.7±4.2 31.9±4.7研究組 16 32.9±4.1 36.8±3.71) 52.5±5.21) 29.3±3.21) 26.3±3.71) 22.6±3.11) 21.6±3.11)t/P值 0.133/0.926 2.164/0.031 11.347/＜0.001 2.527/0.018 5.886/＜0.001 7.145/＜0.001 8.362/＜0.001

表4 兩組TNF-α變化情況(±s，pg/ml)

表4 兩組TNF-α變化情況(±s，pg/ml)

組別 n 術前 第1周 第2周 第4周 第8周 第12周 第16周對照組 17 425.6±118.7 430.6±120.4 431.7±115.6 433.5±127.6 437.5±119.8 438.4±122.7 441.3±142.3研究組 16 421.2±121.5 490.3±176.21) 583.2±213.51) 783.4±253.71) 871.3±273.91) 713.5±283.41)1 089.3±326.51)t/P值 0.105/0.934 1.143/0.206 2.572/0.015 5.069/＜0.001 7.146/＜0.001 9.128/＜0.001 10.862/＜0.001

3 討論

高表達的血管緊張素(Ang)不但可直接作用于血管收縮，還可增強交感神經遞質、內皮素以及醛固酮等物質的釋放，最終參與高血壓的發生、發展〔3〕。NO是血管內皮細胞釋放的一種生理性血壓調節劑，該物質可與血管平滑肌細胞的鳥苷酸環化酶相互作用，并導致cCMP高表達，最終抑制血管擴張，降低平滑肌細胞分裂、增殖〔4〕。此外，NO還可抑制Ang-Ⅱ的合成，抑制腎血管性血壓的升高。研究顯示，口服NO前體L-精氨酸可提供RHRSP的NO合成量，大鼠腎排鈉、排水能力也隨之增強，血壓可顯著控制〔5〕。本研究提示NO合成、釋放與高血壓發生、發展存在重要聯系。在血壓正常的情況，血管張力及動脈血壓可被內皮型NO合酶(eNOS)調節，但在高血壓狀態下，eNOS生成的NO無法滿足血管張力需求，這導致誘導性NOS(iNOS)激活，并合成大量的NO，以滿足調節血壓的需求，這可能是研究組大鼠術后第2周達到最高值后逐漸下降的原因。

炎癥及相關因子與高血壓、心腦血管疾病發生、發展存在重要聯系。TNF-α是人體重要的一種炎癥因子，是炎癥反應的核心因子之一，具有誘導黏附分子表達、刺激細胞生長等多種功能〔6〕。當生物體血壓增高時，血管內異常的血流動力學將導致血管內皮細胞及心肌細胞出現缺氧狀態，進而刺激TNF-α的合成，導致高血壓癥狀進一步惡化。高表達的TNF-α可導致血管收縮、擴張不平衡，同時還可加劇單核細胞的聚集，導致炎性系統激活，并加速動脈粥樣硬化的發展〔7〕。本研究表明TNF-α是高血壓及腦卒中病理改變的重要參與因子。

hs-CRP可直接參與局部或全身性炎癥反應，誘使血管內皮細胞損傷，增高血管阻力〔8〕。hs-CRP還可抑制NO及前列腺素的表達，導致這些物質的血管舒張、抗血栓能力消失，最終加速心血管疾病發展。此外，hs-CRP介導的全身性炎癥反應還可增強白細胞的氧化應激反應，患者機體內超氧陰離子釋放量增多，加速NO的消耗〔9〕。高表達的hs-CRP還可加速血管內皮細胞的增殖、遷移，加速動脈內膜粥樣硬化發展，最終參與高血壓及腦卒中等疾病的發展〔10〕。

綜上，RHRSP模型大鼠存在明顯血管壁內皮功能異常及炎癥反應，CRP、TNF-α、SBP升高及NO降低是這一病理改變的重要影響因素，并共同作用于高血壓性腦卒中的發生、發展，提示臨床可通過檢測CRP、TNF-α、NO來實現高血壓性腦卒中患者的早期診斷和防治干預。

1 張志敏，趙連友，盧 凡，等.高同型半胱氨酸對高血壓大鼠心肌細胞GRP78和CHOP表達及左室肥厚的影響〔J〕.中國循證心血管醫學雜志，2014;1(2):223-6，228.

2 全毅紅，秦 潔.疏血通注射液聯合卡托普利對老年高血壓患者血壓晝夜節律及血漿內皮素和一氧化氮的影響〔J〕.中國動脈硬化雜志，2011;19(4):347-50.

3 萬 鑫，代成波，曹裕民，等.誘導型一氧化氮合酶基因多態性與顱內動脈粥樣硬化的相關性研究〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2013;15(4):382-5.

4 王云玲，張丹紅，肖林琴，等.血栓素A2受體基因多態性在腦梗死發病中的作用〔J〕.中華神經醫學雜志，2013;12(11):1081-6.

5 Sumbria RK，Boado RJ，Pardridge WM.Brain protection from stroke with intravenous TNF-α decoy receptor-Trojan horse fusion protein〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2012;32(10):1933-8.

6 陳麗娜，徐清斌，馬 萍.內皮型一氧化氮合酶基因G894T多態性與寧夏漢族原發性高血壓的相關性研究〔J〕.寧夏醫科大學學報，2011;33(10):909-12.

7 祁玉鳳，李常新，吳曉巍，等.人工寒潮對易卒中型腎血管性高血壓大鼠凝血和纖溶系統的變化研究〔J〕.中西醫結合心腦血管病雜志，2011;9(4):459-62.

8 Zwolinska-Wcislo M，Brzozowski T，Ptak-Belowska A.Nitric oxide-releasing aspirin but not conventional aspirin improves healing of experimental colitis〔J〕.World J Gastroenterol，2011;17(36):4076-89.

9 李 偉，王 淼，張海峰，等.血漿β2-微球蛋白對高血壓患者動脈粥樣硬化的評價探討〔J〕.河北醫學，2014;1(4):597-9.

10 劉淑云，張 平，林仁勇，等.TNF-α預測高血壓大鼠發生腦卒中的實驗研究〔J〕.安徽醫藥，2014;18(3):464-7.