促紅細胞生成素對阿爾茨海默病模型大鼠記憶能力及其超微結構的影響

李宜培 彭蕤蕤 柴高尚 靳 力 王 黎

(河南醫學高等專科學校病理生理學教研室，河南 鄭州 451191)

阿爾茨海默病(AD)是老年癡呆最常見的類型〔1〕，其主要病理學特征為神經細胞外β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積為主的老年斑(SP)〔2，3〕、神經細胞內異常磷酸化的 tau蛋白聚集為核心構成的神經原纖維纏結(NFTs)〔4〕以及皮質、海馬選擇性的神經元變性和缺失〔5〕。Aβ作為老年斑的主要組成成分，被認為是導致神經元損傷和認知功能障礙的主要原因〔6，7〕。近年來的實驗表明，促紅細胞生成素(EPO)作為一種保護性細胞因子，在各種腦損害中發揮著重要的神經保護作用〔8〕。但EPO能否對AD具有神經保護作用，目前國內外尚未見報道。為探討EPO在AD治療中的潛力，本實驗采用大鼠海馬注射凝聚態Aβ1～40的方法復制AD動物模型〔9～11〕，本實驗通過腹腔注射重組人促紅細胞生成素(rHu-EPO)，觀察了EPO對AD大鼠學習記憶的影響和對海馬超微結構的保護作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及實驗處理 雄性Wistar大鼠55只，清潔級，體質量250～300 g，動物批號:SCXK(豫)2005-2001，由河南省實驗動物中心提供。Y迷宮法篩選后，淘汰反應過于靈敏和遲鈍7只大鼠后，48只大鼠隨機分為4組，正常對照組，生理鹽水組，模型組，EPO治療組，每組12只。動物自由飲食，晝夜交替飼養，飼養室溫度保持為15℃～20℃。

1.2 主要試劑和實驗儀器 Aβ1～40(美國Sigma公司)，rHu-EPO(上海克隆生物高技術有限公司)，骨蠟(上海三友醫療器械有限公司)，多聚甲醛(BBI);Y-迷宮(MG-3型)(張家港生物醫學儀器廠)，腦立體定位儀(ZH-藍星B)(安徽省淮北正華生物儀器設備有限公司)，恒溫培養箱(GSP-9080MBE)(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)，透射電子顯微鏡(荷蘭FEI TecnaiG2)，電子天平(METTLER TOLEDO)。

1.3 實驗方法

1.3.1 Aβ1～40孵育 將 1 mg Aβ1～40溶于 500 μl PBS，稀釋為2 μg/μl的濃度，置于37℃恒溫箱中連續孵育12 d，使蛋白充分伸展形成聚合態，然后4℃保存使用，忌反復凍融。

1.3.2 術前訓練 48只大鼠每天上午固定時間Y迷宮訓練，每天20次，連續5 d，每只大鼠都達到學會標準即連續9次在60 s內一次到達安全區。電刺激參數:電壓50～70 V，延時5 s。

1.3.3 大鼠模型的建立 用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(300～360 mg/kg)，然后將其固定于腦立體定位儀上。參照Pellegrino和Cushman合著的《大鼠腦立體定位圖譜》〔2〕定位。定位方法為:以前囟為原點，向后4.0 mm，中線旁2.0～2.5 mm，顱骨面下進針3.0～3.5 mm。用微量進樣器施行注射，每只大鼠注射5μl。生理鹽水組按照AD模型組方法在海馬注射生理鹽水5 μl，正常對照組大鼠不做處理。EPO治療組大鼠在正常喂養的基礎上從造模手術當天開始腹腔注射5 000 IU/kg rHu-EPO，隔天1次，共5次。

1.3.4 Y迷宮行為學測試 手術后第10天各組大鼠進行行為學測試。按照上述學會標準，記錄各組中每只大鼠錯誤次數、嘗試次數和全天總反應時間。

1.3.5 海馬電鏡標本的制作及觀察 造模手術后第10天，Y迷宮測試完畢后，每組隨機抽取兩只用于透射電子顯微鏡取材。6%水合氯醛麻醉大鼠后用4%多聚甲醛400 ml灌注固定。切取海馬組織塊約1 mm3，經漂洗液充分洗滌后，進行梯度脫水。SPURR包埋劑包埋后，荷蘭FEI TECNAIG212透射式電鏡下觀察并照相。

1.3.6 免疫組織化學染色 大鼠行為學測試后，常規灌注固定，石蠟包埋，冠狀位切片，厚6 μm。染色切片經微波爐修復10 min。一抗(兔抗 NGF，1∶100)4℃過夜，ABC 法，DAB 顯色。

1.4 統計學方法 采用SPSS 10.0統計分析軟件，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 行為學及記憶能力的改變 見表1。

表1 各組大鼠學習記憶能力比較(±s，n=12)

表1 各組大鼠學習記憶能力比較(±s，n=12)

與生理鹽水組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

0.39±0.48 10.10±0.28 60.54±5.19生理鹽水組 0.40±0.52 10.10±0.32 63.43±10.99模型組 1.75±1.281) 12.75±1.581) 96.43±23.011)EPO治療組 0.57±0.792) 10.14±0.382) 71.74±8.862)ER AR TRT正常對照組組別

2.2 EPO對大鼠海馬超微結構的影響 正常對照組和生理鹽水組:電鏡下可見海馬神經突觸前后膜均一，厚度適中，突觸前膜內的突觸小泡清晰可見，突觸間隙清晰;線粒體大小及形態正常，線粒體膜、脊完整，內嵴清晰可見，基質均勻，粗面內質網散在分布，表面游離核蛋白體較多。模型組:電鏡下神經細胞形態破壞，結構紊亂。突觸密度降低，且均勻不一，突觸間隙變小不清，突觸小泡數量減少;游離核蛋白體減少，線粒體膜不完整，線粒體嵴模糊。EPO治療組:神經元結構基本正常，突觸前膜內突觸小泡較清晰，突觸間隙清晰;線粒體膜基本完整，線粒體嵴清晰可見，見圖1。

2.3 NGF免疫組化結果 正常對照組和生理鹽水組NGF表達陽性的細胞數無明顯差異;與生理鹽水組比較，模型組NGF表達陽性的細胞明顯減少;與模型組比較，EPO治療組NGF表達陽性的細胞明顯增多，見圖2。

圖1 各組海馬的超微結構

圖2 各組大鼠NGF免疫組化表達(DAB，×400)

3 討論

EPO是刺激紅細胞合成的細胞因子，是組織氧合狀態的一種主要決定因素，目前臨床上多用于貧血的治療。EPO在內源性的神經保護系統中具有重要作用，在腎性貧血的臨床治療中發現，EPO可以提高患者的認知能力。本實驗結果提示EPO可以部分改善AD大鼠的認知功能，發揮神經元保護作用。線粒體是存在于真核生物細胞質中、含有核外遺傳物質的細胞器，是細胞的能力化工廠。大量的證據表明，AD的發生與線粒體的結構和功能障礙密切相關〔12～14〕。突觸是神經元與神經元之間一種特化的細胞連接，是神經元信號傳遞的重要結構，通過它的傳遞作用實現細胞與細胞之間的通訊。學習記憶與中樞神經系統突觸的結構和功能的可塑性密切相關。突觸結構的破壞會中斷腦內很多功能通路中的聯系，引起多方面的功能障礙，尤其嚴重的是認知和記憶障礙〔15〕。研究表明〔16，17〕，突觸脫失是AD患者重要的組織形態學改變之一，其程度與癡呆嚴重程度相互聯，被認為是癡呆患者認知水平下降的基礎。在AD腦中，突觸數量減少以及突觸病理性變化較神經元喪失更顯著，因此，突觸喪失是 AD 癡呆的結構基礎〔16，18，19〕。本研究通過透射電鏡觀察發現，EPO可以減輕大鼠海馬線粒體和突觸的破壞，減輕AD大鼠的海馬超微結構損傷程度，減輕其功能的喪失，進而改善AD大鼠認知功能障礙。

NGF是一類小分子多肽物質，是最早發現的神經營養因子超家族成員，其在促進神經元的生長、發育、分化與成熟，維持神經元的存活及促進神經元損傷后的修復與再生方面有著極其重要的作用〔20～22〕。近來大量有關研究表明NGF缺乏與神經系統的退行性疾病，特別是與AD的發生和發展有著密切的聯系〔21，22〕，本實驗表明，EPO發揮保護AD樣大鼠海馬神經細胞可能與增強海馬組織NGF蛋白的表達有關。

綜上所述，EPO可以改善大鼠由Aβ1～40引起的學習記憶障礙，提高學習記憶能力，這與減輕大鼠海馬線粒體和突觸的破壞，減輕其功能的喪失，增加NGF蛋白表達促進突觸發生有關，其深層機制仍有待進一步探索。

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〔2013-09-27修回〕