Nur77Nur77在不同發(fā)育階段小鼠睪丸的表達(dá)及其功能*

谷亞龍張新東金保方**. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合男科（南京 0009）；. 南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院生殖中心

Nur77Nur77在不同發(fā)育階段小鼠睪丸的表達(dá)及其功能*

谷亞龍1張新東2金保方1**
1. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合男科（南京 210009）；2. 南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院生殖中心

摘要目的 觀察核受體Nur77在不同發(fā)育階段小鼠睪丸的表達(dá)，并探討其對(duì)睪酮合成的作用。方法 用1周齡的ICR雄性小鼠作為幼年期組（相當(dāng)于人類幼年期，n=6），4周齡的ICR雄性小鼠作為性發(fā)育前組（相當(dāng)于人類青春期前，n=6），12周齡的ICR雄性小鼠作為性成熟期組（相當(dāng)于人類青壯年，n=6），12月齡的ICR雄性小鼠作為老年組（相當(dāng)于人類中老年，n=6）。Real time PCR和Western Blot分別檢測(cè)小鼠睪丸中Nur77 mRNA和蛋白水平表達(dá)。體外培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞系MLTC-1，Nur77干涉腺病毒（Ad-siNur77）及空載腺病毒（Ad-CMV）轉(zhuǎn)染MLTC-1。放射免疫法檢測(cè)MLTC-1細(xì)胞培養(yǎng)液上清的睪酮含量，Real time PCR和Western Blot檢測(cè)StAR及HSD3B的表達(dá)。結(jié)果 Nur77的mRNA水平在青春期前表達(dá)量最高，蛋白水平則在性成熟期小鼠睪丸中最高；Nur77干涉后MLTC-1細(xì)胞的睪酮合成含量較未干涉組明顯降低；Nur77干涉后MLTC-1細(xì)胞的StAR和HSD3B的表達(dá)較未干涉組明顯降低。結(jié)論 Nur77在小鼠睪丸組織的表達(dá)隨年齡變化而變化，這種變化對(duì)于維持小鼠體內(nèi)的睪酮水平可能有重要意義。

關(guān)鍵詞Nur77; 睪酮; 萊迪希細(xì)胞

Key woorrddss Nur77; Testosterone; Leydig cells

睪酮的合成是在下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控下涉及到睪丸內(nèi)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與的復(fù)雜過程。Leydig細(xì)胞是雄性體內(nèi)睪酮合成的主要細(xì)胞，在Leydig細(xì)胞內(nèi)睪酮合成的過程大致如下：在間質(zhì)細(xì)胞刺激素（ICSH）的作用下，類固醇快速合成蛋白（StAR）被激活，膽固醇由線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)膜，然后在細(xì)胞色素膽固醇側(cè)鏈裂解酶的作用下生成孕烯醇酮，孕烯醇酮在3β-羥類固醇脫氫酶（HSD3B）作用下轉(zhuǎn)化為孕酮，孕酮在17a-羥化酶催化下轉(zhuǎn)化為17a-羥孕酮，后者轉(zhuǎn)化為雄烯二酮后合成為睪酮[1]。但是，睪酮合成所涉及到的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的參與仍不清楚。

孤核受體Nur77是調(diào)控類固醇合成酶基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子之一。研究表明，LH能夠上調(diào)Leydig細(xì)胞Nur77的表達(dá)[2]；雌二醇（E2）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等均是通過下調(diào)Nur77的表達(dá)，抑制Leydig細(xì)胞合成睪酮[3, 4]，而環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雙酚A (Bisphenol A) 可通過上調(diào)Nur77，促進(jìn)Leydig細(xì)胞合成睪酮[5]；這均提示Nur77是介導(dǎo)Leydig細(xì)胞合成睪酮的關(guān)鍵基因。但是，在睪丸中，Nur77是否能夠促進(jìn)Leydig細(xì)胞睪酮合成，仍不清楚。

在本研究中，我們檢測(cè)不同年齡段小鼠睪丸組織中Nur77表達(dá)，并在體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中討論其在睪酮生成方面的潛在功能，增加我們對(duì)Nur77在睪酮合成方面的認(rèn)識(shí)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

（一）動(dòng)物與細(xì)胞

ICR雄性小鼠：1周齡（n=6）、4周齡（n=6）、2周齡（n=6）和12月齡（n=6）；飼養(yǎng)環(huán)境：濕度：50%～70%，溫度20℃～22℃；光照周期12h/12h；充足食物和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)后使用。

MLTC-1細(xì)胞購自上海細(xì)胞生命科學(xué)院，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%

O2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

（二）試劑

1640培養(yǎng)液，胰蛋白酶，胎牛血清（FBS）均購自Gibco公司；Nur77、GAPDH引物由上海英俊公司合成；兔Nur77抗體，兔HSD3B抗體，鼠StAR抗體，鼠GAPDH抗體購自Abcam公司；HRP二抗購自Jackson公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑和熒光定量PCR試劑均購自TaKaRa公司；Trizol購自Invitrogen公司；放免法測(cè)定試劑盒購自北方生物技術(shù)研究所；全蛋白提取試劑盒購自南京凱基公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自上海碧云天公司；AdsiNur77及Ad-CMV由上海吉?jiǎng)P生物有限公司制備擴(kuò)增。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）組織取材

實(shí)驗(yàn)中使用的1周齡ICR雄性小鼠，對(duì)應(yīng)于人類的幼年期，作為性未發(fā)育組；4周齡的ICR雄性小鼠，對(duì)應(yīng)于人類青春期前，作為性發(fā)育前組；12周齡ICR雄性小鼠，對(duì)應(yīng)于人類青壯年，作為性發(fā)育成熟組；12個(gè)月的ICR雄性小鼠，對(duì)應(yīng)于人類中老年男子，作為老年組。每只小鼠，脫頸處死，取雙側(cè)新鮮睪丸組織用冰鹽水清洗，放入液氮中凍存，用于總蛋白和總RNA的提取。

（二）轉(zhuǎn)染

用Ad- CMV（100MOL）和Ad-siNur77 （100MOL）配制細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染MLTC-1細(xì)胞。24h后換普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，用于mRNA和蛋白的檢測(cè)。

（三）睪酮測(cè)定

用Ad- CMV（100MOL）和Ad-siNur77 （100MOL）配制細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染MLTC-1細(xì)胞。24小時(shí)后換普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集上清，用放射免疫法（RIA）檢測(cè)睪酮含量（具體參照RIA試劑盒說明）。

（四）mRNA檢測(cè)

用Trizol法萃取樣品總RNA，提取的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒按20μL體系反轉(zhuǎn)成cDNA，所有的RTPCR反應(yīng)使用SYBR Green PCR試劑盒在StepOne PlusTM Real-Time PCR序列檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行，管家基因GAPDH作為內(nèi)部參照。引物序列：Nur77，F(xiàn)P：5'-GAC CCC ACT ATT TGT CTT ATC CC-3'，RP：5'-CCC ATC TCA ACC TCT TGC TTT C-3'；StAR，F(xiàn)P：5'-CGG GTG GAT GGG TCA AGT TC-3'，RP：5'-GCA CTT CGT CCC CGT TCT C-3'；HSD3B：FP：5'-GTG GGG CTT CTG CCT TGA T-3'，RP：5'-GGT TTT CTG CTT GGC TTC CTC-3'；GAPDH：FP：5'-AGG TTG TCTCCT GCG ACT TCA-3'，RP：5'-GGG TGG TCCAGG GTT TCT TAC T-3'。Real-Time PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5min，40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 30s，60 ℃ 1min。進(jìn)行溶解曲線分析，確定產(chǎn)物是否單一，使用2-??CT方法計(jì)算目標(biāo)mRNA的相對(duì)豐度，數(shù)據(jù)以百分比表示。

（五）蛋白檢測(cè)

蛋白裂解液充分裂解樣品，12 000×g，4 ℃，15min收取上清，-70 ℃保存，用于Western印跡分析處理。使用時(shí)，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每條泳道上樣40μg，用10%SDS-PAGE分離，隨后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1h，將膜與一抗4 ℃孵育過夜，各個(gè)抗體濃度為兔抗小鼠Nur77（1:1000），兔抗小鼠HSD3B （1:1000），鼠抗小鼠StAR（1:1000）,鼠抗小鼠GAPDH（1:5000），一抗孵育完成后，TBST 37 ℃洗滌3次，每次10min，再用HRP標(biāo)記的抗兔和抗鼠二抗（1:5000）37 ℃孵育1h，二抗孵育完成后TBST 37 ℃洗滌3次，隨后曝光顯影。以GAPDH作為內(nèi)參校正上樣誤差。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，單因素樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同發(fā)育階段小鼠睪丸組織中Nur77 mRNA mRNA及蛋白的表達(dá)水平

Nur77 mRNA在1周齡小鼠（幼年期）睪丸組織中表達(dá)量極低，而在4周齡小鼠（青春前期）睪丸組織中表達(dá)量最高，與幼年組相比，青春前期組睪丸中表達(dá)量明顯增加（P＜0.01），12周齡小鼠（青壯年期）及12月齡小鼠（中老年期）睪丸組織中表達(dá)量則逐漸降低。蛋白水平與mRNA水平并不完全同步，Nur77蛋白的表達(dá)量在1周齡小鼠（幼年期）睪丸組織中表達(dá)量最低，其后逐漸增加，到12周齡小鼠（青壯年期）Nur77蛋白在睪丸組織中的表達(dá)達(dá)到高峰，12個(gè)月齡小鼠（中老年期）Nur77蛋白又顯著下降，見圖1。

二、干涉Nur77Nur77下調(diào)了MLTC-1LTC-1細(xì)胞的睪酮合成

MLTC-1細(xì)胞在轉(zhuǎn)染Ad-siNur77后，能降低睪酮的合成（圖2A2A），轉(zhuǎn)染Ad-siNur77后與轉(zhuǎn)染Ad- CMV相比，細(xì)胞上清的睪酮含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖1 不同發(fā)育階段小鼠睪丸中Nur77Nur77的表達(dá)水平

三、干涉Nur77Nur77下調(diào)了MLTC-1LTC-1細(xì)胞內(nèi)StARStAR和HSD3BHSD3B的表達(dá)

Real time PCR的結(jié)果顯示，Ad-siNur77轉(zhuǎn)染MLTC-1細(xì)胞后，能降低StAR、HSD3B mRNA的表達(dá)（圖3A3A、圖3B3B），轉(zhuǎn)染Ad-siNur77后與轉(zhuǎn)染Ad-CMV相比，StAR、HSD3B mRNA的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

Western blot的結(jié)果顯示，Ad-siNur77轉(zhuǎn)染MLTC-1細(xì)胞后，能降低StAR、HSD3B 蛋白的表達(dá)（圖3C3C、圖3D3D），轉(zhuǎn)染Ad-siNur77后與轉(zhuǎn)染Ad-CMV相比，StAR、HSD3B 蛋白的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

討 論

圖2 Nur77阻斷下調(diào)了MLLTTCC--11細(xì)胞的睪酮合成

圖3 Nur777阻斷下調(diào)了MLLTTCC--11細(xì)胞SSttAARR和HHSSDD33BB的表達(dá)

睪酮的合成是一個(gè)受多種酶促反應(yīng)調(diào)節(jié)的反應(yīng)過程，各種酶和調(diào)節(jié)因子的表達(dá)與睪丸的發(fā)育階段有著密切的關(guān)系。胚胎兒初期就有睪酮的分泌，妊娠12周時(shí)達(dá)高峰，此后開始下降，出生時(shí)最低。緊接著又開始上升，出生2個(gè)月時(shí)達(dá)到一個(gè)較高的濃度，然后再次下降，維持靜止的水平直至青春期，青春期時(shí)在黃體生成素（LH）的刺激下，睪酮水平不斷上升，20～29歲時(shí)達(dá)最高峰值，以后隨年齡增長(zhǎng)又出現(xiàn)下降[6]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Nur77的表達(dá)與哺乳動(dòng)物體內(nèi)睪酮的含量變化趨同，表明Nur77可能與睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成睪酮相關(guān)。

Nur77是孤核受體家族的一員，是即早反應(yīng)（early-response）基因的一種，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與調(diào)控細(xì)胞的多種功能活動(dòng)。在Leydig細(xì)胞中，Nur77受LH的刺激而表達(dá)增高，促進(jìn)睪酮合成[2]；雌二醇（E2）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等可以通過下調(diào)Nur77的表達(dá)，抑制Leydig細(xì)胞合成睪酮[3, 4]。這均提示Nur77是介導(dǎo)Leydig細(xì)胞合成睪酮的正向調(diào)節(jié)因子。我們的研究發(fā)現(xiàn)干涉MLTC-1細(xì)胞Nur77的表達(dá)，基礎(chǔ)狀態(tài)下的睪酮合成變少，提示Nur77是睪丸間質(zhì)細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下睪酮合成的關(guān)鍵因子。

在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)干涉Nur77下調(diào)了StAR 和HSD3B的表達(dá)。有研究表明，在StAR和HSD3B的啟動(dòng)子上存在Nur77的結(jié)合位點(diǎn)，Nur77單獨(dú)或者同其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，增加StAR和HSD3B的表達(dá)[7, 8]。這很可能是Nur77調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成的分子機(jī)制。

在本研究中，我們觀察了Nur77在不同年齡段小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況，體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)確定了Nur77是睪酮合成的正向調(diào)節(jié)因子。然而，由于技術(shù)原因所限制，未能在動(dòng)物體內(nèi)研究Nur77與動(dòng)物睪酮合成的關(guān)系，為本研究尚待完善之處。

參 考 文 獻(xiàn)

1 Payne AH, Youngblood GL. Regulation of expression of steroidogenic enzymes in Leydig cells. Biol Reprod 1995; 52(2): 217-225

2 Song KH, Park JI, Lee MO, et al. LH induces orphan nuclear receptor Nur77 gene expression in testicular Leydig cells. Endocrinology 2001; 142(12): 5116-5123

3 Lee SY, Park E, Kim SC, et al. ERalpha/E2 signaling suppresses the expression of steroidogenic enzyme genes via cross-talk with orphan nuclear receptor Nur77 in the testes. Mol Cell Endocrinol 2012; 362(1-2): 91-103

4 Lee SY, Gong EY, Hong CY, et al. ROS inhibit the expression of testicular steroidogenic enzyme genes via the suppression of Nur77 transactivation. Free Radic Biol Med 2009; 47(11): 1591-1600

5 Song KH, Lee K, Choi HS. Endocrine disrupter bisphenol a induces orphan nuclear receptor Nur77 gene expression and steroidogenesis in mouse testicular Leydig cells. Endocrinology 2002; 143(6): 2208-2215

6 Lamberts SW, van den Beld AW, van der Lely AJ. The endocrinology of aging. Science 1997; 278(5337): 419-424

7 Martin LJ, Tremblay JJ. The human 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/Delta5-Delta4 isomerase type 2 promoter is a novel target for the immediate early orphan nuclear receptor Nur77 in steroidogenic cells. Endocrinology 2005; 146(2): 861-869

8 Martin LJ, Boucher N, Brousseau C, et al. The orphan nuclear receptor NUR77 regulates hormone-induced StAR transcription in Leydig cells through cooperation with Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase I. Mol Endocrinol 2008; 22(9): 2021-2037

（2015-01-15收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.04.002

中圖分類號(hào)R 347.911

*基金項(xiàng)目資助: 南京中醫(yī)藥大學(xué)青年自然科學(xué)基金（12XZR13）; 國家自然科學(xué)基金青年基金（81302969）;國家自然科學(xué)基金（81273760）; 國家自然科學(xué)基金（81473678）

Expression and function of Nur77 in testes of mice at different developmental stages*

Gu Yalong1, Zhang Xindong2, Jin Baofang1**
1. Andrology Department of Integrative Medicine, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China;
2. Reproductive Medicine Center, Department of Obstetrics and Gynecology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing
University Medical School
Corresponding author: Jin Baofang, E-mail: hexiking@126.com

AbstractObjectivess To observe the expression of Nur77 in the testes of mice at different developmental stages, and discuss its potential function in regulating androgen production. Metthhooddss Total of 24 ICR male mice at different developmental stages (one week as the infancy group; 4 weeks as the prepubertal group; 12 weeks as the adult group; over 12 months as the ageing group) were used in this study. Expression of Nur77 was detected by Real time PCR and Western Blot respectively. Testosterone level in medium of MLTC-1 cells transfected with Ad-siNur77 or Ad-CMV was measured by radioimmunoassay, meanwhile the expression levels of StAR and HSD3B in the transfected cells were also evaluated by realtime PCR and western blot. Ressuullttss Expression of Nur77 mRNA in the prepubertal group was signifi cantly higher than that in the adult group, while expression of Nur77 protein in the adult group was at highest level among four groups. AdsiNur77 inhibited the testosterone synthesis of MLTC-1 cells compared with the control group. Ad-siNur77 repressed mRNA and protein expression of StAR and HSD3B. Conclussiioonn Nur77 protein expression in the testis tissue was correlated with the age of mice, which may be signifi cant for maintaining testosterone levels in mice.

**通訊作者, E-mail: hexiking@126.com