BDNFBDNF過(guò)表達(dá)的MSCsMSCs成功干預(yù)大鼠神經(jīng)性陰莖勃起功能障礙的實(shí)驗(yàn)研究*

沈寒堅(jiān) 楊小萍朱廣友 沈 彥 王飛翔司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所，上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海 200063）

·論 著·

BDNF
BDNF過(guò)表達(dá)的MSCsMSCs成功干預(yù)大鼠神經(jīng)性陰莖勃起功能障礙的實(shí)驗(yàn)研究*

沈寒堅(jiān) 楊小萍**朱廣友 沈 彥 王飛翔
司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所，上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海 200063）

摘要目的 探索在海綿體神經(jīng)損傷的大鼠神經(jīng)性陰莖勃起功能障礙（NED）模型中，注射BDNF過(guò)表達(dá)的MSCs在神經(jīng)再生和修復(fù)中的作用。方法 建立腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）過(guò)表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），通過(guò)Western Blot檢測(cè)BDNF和VEGF-A的表達(dá)的水平。 通過(guò)Elisa檢測(cè)BDNF和VEGF-A在細(xì)胞上清液中的含量。取120只3月齡大鼠隨機(jī)分為4組：第1組為假手術(shù)組（Sham組）， 其余三組均損傷雙側(cè)海綿體神經(jīng)， 第2組（Control組）不再進(jìn)行干預(yù)， 第3組（MSC組）和第4組（BDNF-MSC）分別在關(guān)腹前注射MSCs和BDNF過(guò)表達(dá)的MSCs。大鼠在手術(shù)造模后12周，通過(guò)海綿體神經(jīng)電刺激并測(cè)陰莖海綿體內(nèi)壓（ICP）來(lái)評(píng)價(jià)陰莖勃起功能。取大鼠陰莖海綿體組織行免疫組化評(píng)價(jià)誘導(dǎo)型NO合酶（iNOS）的表達(dá)水平。結(jié)果 通過(guò)綠色免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)BDNF過(guò)表達(dá)MSCs 制備成功。Western Blot驗(yàn)證結(jié)果顯示BDNF過(guò)表達(dá)的MSC細(xì)胞中的BDNF和VEGF-A表達(dá)水平較MSC細(xì)胞明顯上調(diào), ELISA驗(yàn)證結(jié)果顯示BDNF過(guò)表達(dá)的MSC細(xì)胞上清液中的BDNF和VEGF-A表達(dá)水平較MSC細(xì)胞上清液明顯上調(diào)。手術(shù)后12周，通過(guò)海綿體神經(jīng)電刺激并測(cè)ICP來(lái)評(píng)價(jià)陰莖勃起功能，其中假手術(shù)組平均最大ICP為（102.20±15.61）cmH2O，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為（35.47±13.16），MSC干預(yù)組為（43.79±16.94）cmH2O，BDNF-MSC干預(yù)組為（66.04±15.33）cmH2O。免疫組化結(jié)果顯示，BDNF-MSC干預(yù)組大鼠陰莖海綿體組織內(nèi)iNOS陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯高于MSC干預(yù)組。結(jié)論 本研究結(jié)果顯示局部注射MSCs和BDNF過(guò)表達(dá)的MSCs對(duì)于大鼠的NED具有治療作用。

關(guān)鍵詞勃起功能障礙; 間質(zhì)干細(xì)胞; 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

男性勃起功能障礙（ED）是指男性持續(xù)性或反復(fù)發(fā)作的難以達(dá)到和維持陰莖勃起，進(jìn)而無(wú)法完成性交和滿意性活動(dòng)的病理現(xiàn)象。陰莖的勃起依賴于一系列正常的神經(jīng)和血管性反應(yīng)，包括正常的性心理反應(yīng)，正常的生理結(jié)構(gòu)，正常的內(nèi)分泌、神經(jīng)和血管功能等，任何一個(gè)環(huán)節(jié)的異常都有可能導(dǎo)致ED。神經(jīng)性陰莖勃起功能障礙（NED）約占ED的10%～19%，主要的相關(guān)病變包括急性神經(jīng)損傷、前列腺癌、糖尿病和帕金森病等，海綿體神經(jīng)（CN）的損傷最為常見(jiàn)，是最主要的致病因素。盆腔惡性腫瘤術(shù)后或者外傷后，ED的發(fā)生率明顯升高，因?yàn)樵谑中g(shù)及外傷過(guò)程中CNs可能會(huì)被切斷、撕裂或者牽拉等，從而造成其損傷。目前，磷酸二酯酶-5（PDE-5）抑制劑（如西地那非等）是臨床治療ED的一線藥物，但是它對(duì)ED患者療效欠佳。干細(xì)胞技術(shù)是近年來(lái)生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)尖端技術(shù)，已在各個(gè)學(xué)科廣泛應(yīng)用，尤其是干細(xì)胞治療技術(shù)更是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究通過(guò)損傷CN構(gòu)建大鼠NED模型，用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）過(guò)表達(dá)的MSC來(lái)干預(yù)NED大鼠，對(duì)其治療效果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

材料與方法

一、材料

BDNF過(guò)表達(dá)的慢病毒載體和MSC由復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院友情提供。用BDNF過(guò)表達(dá)的慢病毒載體感染MSC，制備BDNF過(guò)表達(dá)的MSC（BDNFMSC）。將接種目的細(xì)胞置于6cm培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到30%～45%左右時(shí)，加入3mL的病毒上清，同時(shí)加入2mL含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入polybrene至終濃度4～8μg/mL，24h后更換為正常培養(yǎng)基。48h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞感染效率。通過(guò)Western-blot和ELISA方法驗(yàn)證BDNF-MSC中 BDNF的表達(dá)情況。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取成年雄性SD大鼠120只（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供），體重200～300g，實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)入研究前交配試驗(yàn)證實(shí)均有正常的性功能，在14 h光照/10 h黑暗周期恒溫環(huán)境下圈養(yǎng)，隨意進(jìn)食，直至試驗(yàn)的當(dāng)天。將 120只大鼠分為4組：（1）假手術(shù)組（Sham組），即大鼠下腹正中切口后，暴露并游離出盆腔星狀神經(jīng)節(jié)（Major pelvic ganglion, MPG）和海綿體神經(jīng)，不經(jīng)任何其他處理即縫合關(guān)閉腹膜和皮膚；（2）實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（Control組），步驟如第一組，在關(guān)腹前用血管鉗夾閉海綿體神經(jīng)2min，造成神經(jīng)損傷，之后關(guān)閉縫合腹膜和皮膚；（3）MSC干預(yù)組，前序步驟如第二組，在關(guān)腹前向海綿體神經(jīng)損傷區(qū)周圍注射20μL的MSC（1×106）細(xì)胞懸液，之后關(guān)閉縫合腹膜和皮膚；（4）BDNF-MSC干預(yù)組，其他步驟同第三組，注射液改為20μL BDNF-MSC（1 ×106）細(xì)胞懸液。大鼠行手術(shù)處理后，繼續(xù)上述方法飼養(yǎng)12周。

三、手術(shù)方式

所有手術(shù)均在無(wú)菌操作下完成，均以4%水合氯醛（1ml/100g）腹腔麻醉。將麻醉好的大鼠仰臥固定于解剖板上, 行下腹正中切口，提起包皮沿陰莖背側(cè)正中剪開(kāi)皮膚,直至恥骨聯(lián)合下方，長(zhǎng)約3cm，游離腹側(cè)陰莖皮膚近端至睪丸上極，打開(kāi)腹腔，提出睪丸，暴露背側(cè)前列腺，在10倍外科顯微鏡下仔細(xì)游離前列腺兩側(cè)葉后方, 可暴露出盆腔星狀神經(jīng)節(jié), 沿盆腔星狀神經(jīng)節(jié)向周圍仔細(xì)分離可識(shí)別出盆神經(jīng)、腹下神經(jīng)這兩支主要的輸入支以及沿尿道側(cè)面走行的最大輸出支-海綿體神經(jīng)。所有神經(jīng)均經(jīng)多道生理記錄儀（美國(guó) BIOPAC 公司，MP150 型）電刺激，觀察陰莖勃起反應(yīng)予以確認(rèn)。至此，第一組30只大鼠關(guān)閉腹膜，逐層縫合。后三組大鼠游離海綿體神經(jīng)并于近端用血管鉗夾閉海綿體神經(jīng)2min，造成神經(jīng)損傷。第二組大鼠在海綿體神經(jīng)損傷之后關(guān)閉縫合腹膜和皮膚，逐層縫合。第三組大鼠在關(guān)閉腹膜前向海綿體神經(jīng)損傷區(qū)周圍注射20μL的MSC（1×106）細(xì)胞懸液，之后關(guān)閉縫合腹膜和皮膚，第四組大鼠注射液改為20μL BDNF-MSC（1×106）細(xì)胞懸液。所有大鼠待清醒后送至動(dòng)物房繼續(xù)飼養(yǎng)。

四、陰莖海綿體神經(jīng)電刺激及海綿體內(nèi)壓（ICPICP）監(jiān)測(cè)

大鼠行手術(shù)造模后12周，將建模后的大鼠腹腔麻醉后如前所述再次游離出陰莖海綿體神經(jīng)，用間距1 mm 的雙極電極勾住海綿體神經(jīng)，液體石蠟保護(hù)神經(jīng)周圍，調(diào)整生理多用儀參數(shù): 刺激電流1.6mA，刺激時(shí)間0.2ms，頻率20Hz，直至陰莖膨脹、勃起，證實(shí)陰莖海綿體神經(jīng)的應(yīng)用解剖學(xué)走行。將插入一側(cè)陰莖海綿體的25G針頭連接于壓力傳感器和四路放大器，后者再連接到資料獲取模塊，并采用SMUP2PC型生物信號(hào)處理系統(tǒng)在計(jì)算機(jī)上記錄數(shù)據(jù)。

五、取材

將測(cè)量ICP之后的大鼠處死，取陰莖海綿體組織并立即加入液氮中，置于-80℃冰箱保存。

六、統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用軟件Graphpad prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并輸出圖片，用非配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)4組大鼠海綿體神經(jīng)電剌激后的ICP數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

結(jié) 果

一、細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

用BDNF過(guò)表達(dá)的慢病毒載體感染MSC，成功制備BDNF過(guò)表達(dá)的MSC（BDNF-MSC）。圖1和圖2分別為慢病毒載體感染MSC后的熒光和白光照片。

圖1 慢病毒載體（BDNFBDNF過(guò)表達(dá)）感染MSCMSC后48h48h的熒光照片

二、BDNFBDNF過(guò)表達(dá)驗(yàn)證

（一）Western驗(yàn)證

Western-blot驗(yàn)證結(jié)果顯示BDNF過(guò)表達(dá)的MSC細(xì)胞中的BDNF和VEGF-A表達(dá)水平較MSC細(xì)胞明顯上調(diào)（見(jiàn)圖3）。

圖2 慢病毒載體（BBDDNNFF過(guò)表達(dá)）感染MMSSCC后4488hh的白光照片

圖3 BBDDNNFF過(guò)表達(dá)MMSSCC細(xì)胞中的BBDDNNFF和VEEGGFF--AA表達(dá)均明顯上調(diào)

（二）細(xì)胞上清液ELISA測(cè)定

取MSC細(xì)胞和BDNF過(guò)表達(dá)的MSC細(xì)胞的上清液，ELISA方法測(cè)定BDNF和VEGF-A的水平，結(jié)果顯示BDNF過(guò)表達(dá)的MSC細(xì)胞上清液中的BDNF和VEGF-A表達(dá)水平較MSC細(xì)胞上清液明顯上調(diào)（見(jiàn)圖4）。

三、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（一）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

所有120只大鼠在進(jìn)行手術(shù)處理過(guò)后的12周中，第一組、第四組各死亡一只，第二組、第三組各死亡兩只。最終進(jìn)入測(cè)量ICP的大鼠為114只。

（二）海綿體內(nèi)壓測(cè)量結(jié)果

假手術(shù)組平均最大ICP為（102.20±15.61）cmH2O，N=29；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為（35.47±13.16）cmH2O，N=28；MSC干預(yù)組為43.79±16.94，N=28；BDNF-MSC干預(yù)組為66.04±15.33，N=29。其中第四組與第二組、第三組比較，最大ICP均有顯著性提高，P＜0.001（見(jiàn)圖5）。

圖4 BDNFBDNF過(guò)表達(dá)MSCMSC細(xì)胞上清液的BDNFBDNF和VEGF-AEGF-A表達(dá)明顯上調(diào)

圖5 各組陰莖海綿體內(nèi)壓測(cè)定結(jié)果

（三）陰莖海綿體組織免疫組化結(jié)果

取處死大鼠的陰莖中段海綿體制成組織切片，并行免疫組化結(jié)果顯示，BDNF-MSC干預(yù)組（見(jiàn)圖6A6A）大鼠陰莖海綿體組織內(nèi)誘導(dǎo)型NO合酶（iNOS）陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯高于MSC干預(yù)組（見(jiàn)圖6B6B）。細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中呈現(xiàn)棕黃色顆粒為iNOS陽(yáng)性表達(dá)（如圖6A6A中箭頭所示）。

圖6 免疫組化結(jié)果

討 論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是起源于中胚層的一類多能干細(xì)胞，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，不但可以分化為中胚層組織細(xì)胞如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等[1]，還可以分化為非中胚層細(xì)胞如肺上皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞及肝細(xì)胞等[2]。既往的研究顯示，MSC具有促進(jìn)組織修復(fù)的功能[3, 4]。即使MSC在某些組織的修復(fù)中發(fā)揮重要作用，其應(yīng)該不具有直接誘導(dǎo)神經(jīng)再生的作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大鼠陰莖海綿體內(nèi)注射MSC，可以修復(fù)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的勃起功能障礙[5, 6]。但是，需要進(jìn)一步的研究去證實(shí)，MSC是否可以直接作用于海綿體神經(jīng)。

我們通過(guò)制備大鼠NED模型來(lái)研究MSC對(duì)于NED是否具有治療作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NED大鼠陰莖海綿體內(nèi)注射MSC后12周，ICP有部分升高，說(shuō)明其對(duì)于NED有一定的修復(fù)作用，但是未達(dá)到我們所希望的預(yù)期效果。有報(bào)道顯示，周圍神經(jīng)切斷后，雪旺細(xì)胞和神經(jīng)元分泌的BDNF對(duì)于軸突的再生有重要作用[7]。另一項(xiàng)研究顯示，神經(jīng)肌肉系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境中保持正常水平的BDNF，對(duì)于維持神經(jīng)肌肉系統(tǒng)的活力以及可塑性有重要作用[8]。同時(shí)，BDNF除了可以作用于神經(jīng)細(xì)胞外，還可以調(diào)節(jié)衛(wèi)星細(xì)胞的分化和促進(jìn)骨骼肌的再生[9]。在大腦中動(dòng)脈梗死的大鼠模型中，BDNF基因修飾的MSC具有明顯的修復(fù)作用[10]。基于上述研究成果，我們考慮是否可以將MSC和BDNF的作用聯(lián)合起來(lái)。因此，我們制備了可以表達(dá)BDNF基因的慢病毒載體，并以此制備了可以穩(wěn)定過(guò)表達(dá)BDNF的MSC。在用BDNF過(guò)表達(dá)的MSC干預(yù)NED大鼠12周后，我們發(fā)現(xiàn)ICP較MSC干預(yù)組有明顯升高。從宏觀的層面來(lái)看，BDNF過(guò)表達(dá)的MSC可以成功干預(yù)NED大鼠，使其勃起功能明顯恢復(fù)，但是其分子機(jī)制尚未完全清楚。

我們通過(guò)分析BDNF-MSC和其上清液，發(fā)現(xiàn)VEGF-A的表達(dá)均明顯增高。既往的研究顯示，VEGF除了可以作用于血管內(nèi)皮以外，還具有很多同神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相似的作用[11, 12]，如VEGF對(duì)于大鼠的盆大神經(jīng)節(jié)有營(yíng)養(yǎng)作用[13]。另外，在對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，BDNF可以通過(guò)激活MEKERK和PI3K/AKT信號(hào)通道，誘導(dǎo)VEGF的分泌[14]。據(jù)此，我們推測(cè)在BDNF-MSC促進(jìn)大鼠NED恢復(fù)的過(guò)程中，VEGF可能也發(fā)揮了重要作用。

既往的研究顯示，通過(guò)激活VEGF受體1，可以增加eNOS和iNOS的表達(dá)[15]，而iNOS是重要的心血管系統(tǒng)的保護(hù)蛋白[16]。通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)BDNF-MSC干預(yù)組大鼠的陰莖海綿體組織內(nèi)iNOS陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯高于MSC干預(yù)組。據(jù)此，我們推測(cè)，BDNF-MSC之所以可以促進(jìn)NED大鼠的陰莖勃起功能的恢復(fù)，除了修復(fù)其海綿體神經(jīng)外，可能還通過(guò)VEGF-A促進(jìn)iNOS等血管保護(hù)蛋白的分泌，對(duì)于陰莖海綿體組織的血管內(nèi)皮也有一定的修復(fù)作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，BDNF轉(zhuǎn)染的MSC對(duì)于大鼠NED具有明顯的治療作用，但其分子機(jī)制有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（2015-02-25收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.04.001

中圖分類號(hào)R 698.1

*基金項(xiàng)目資助: 本課題獲中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助（編號(hào)：GY2012G-3）**通訊作者, E-mail: yangxp@ssfjd.cn

Mesenchymal stem cells with BDNF overexpression is a potential cure for neurogenic erectile dysfunction*

Shen Hanjian, Yang Xiaoping**, Zhu Guangyou, Shen Yan, Wang Feixiang
Institute of Forensic Science, Ministry of Justice,Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine, Shanghai 200063, China Corresponding author: Yang Xiaoping, E-mail: yangxp@ssfjd.cn

AbstractObjective To investigate the effects of intracavernosal injection with brain-derived neurotrophic factor (BDNF) overexpressed mesenchymal stem cells (BDNF-MSCs) on recovery of erectile function after cavernous nerve injury (CNI). Methodsthods Stable MSCs with BDNF over epression were fi rst established. Western blot and ELISA were applied to detect the levels of BDNF and Vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) in cells or their supernatants respectively. A total of 120 3-month-old Sprague-Dawley (SD) rats were used in the study and they were divided randomly into four groups. Rats in sham-operated group were treated with a sham operation without cavernous nerve manipulation. Rats in the other three groups were treated with bilateral CNI,but rats in the control group had no further manipulation. Rats in MSC and BDNF-MSC groups were treated by intracavernosal injection with MSCs or BDNF-MSCs respectively. Erectile function was assessed by cavernosal nerve electrostimulation 12 weeks after operation. The penile tissues werethen collected for analysis of inducible nitric oxide synthase (iNOS) level. Resultssults BDNF-MSC cells were successfully established. Western blot and ELISA results demonstrated that both BDNF and VEGF-A were all increased in the BDNFMSC cells and its supernatant, as compared with that in MSC cells. After nerve crushing, the erectile functional evaluation of rats in the control group at 3 months showed a lower mean maximal intracavernous pressure (ICP) under CN stimulation, at (35.47±13.16)cmH2O, than that of rats in the sham group, at (102.20±15.61)cmH2O. Meanwhile, the ICP of BDNF-MSC group was signifi cantly higher than that of the controls, at (66.04±15.33)cmH2O. Immunohistochemical staining showed an increase of iNOS in penile smooth muscle cells of BDNF-MSC group. Conclusionusion Intracavernous injection with BDNF-overexpressed MSCs may enhance the therapeutic effect of MSCs for the treatment of erectile dysfunction.

Key wordsords erectile dysfunction; mesenchymal stem cell; brain-derived neurotrophic factor