柱后碘衍生—高效液相色譜法測定脂必妥片中黃曲霉毒素B1的含量

羅 霄，代 琪，曾 楨，汪 丹

(1.成都市食品藥品檢驗研究院，四川 成都 6101061;2.成都大學 基礎醫(yī)學與護理學院，四川 成都 610106;3.四川大學 華西藥學院，四川 成都 610041)

0 引 言

脂必妥片收載于國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標準WS-11524(ZD-1524)-2002-2013Z，由紅曲單味藥制備而成，具有健脾消食、除濕祛痰、活血化瘀的功效，常用于脾瘀阻滯、癥見氣短及高血脂癥等疾病的輔助治療.由于紅曲制備過程中易產生黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)，該毒素是黃曲霉和寄生曲霉中產毒菌株的代謝產物，普遍存在于霉變的糧食及糧食制品中，長期攝入對人體會造成極大傷害［1－2］.黃曲霉毒素主要有4 種，G1、G2、B1、B2，其中B1 被認為是主要的有毒物質［3］.研究發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素B1(AFT B1)含有一個雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰酮(香豆素)，前者為基本毒性結構，后者與致癌有關［4］.鑒于AFT B1 對人體的危害，建立AFT B1 高效定量的檢測方法已成為研究重點.對此，本研究采用有機溶劑提取、免疫親和柱(IAC)凈化分離和柱后碘衍生—高效液相色譜法，建立了AFT B1 的含量測定方法，擬為該制劑的安全保證提高提供科學依據(jù).

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

實驗所用儀器包括:Waters2998 高效液相色譜儀，熒光檢測器，AE-240 電子天平(德國賽多利斯公司)，AUX-220 電子天平(日本島津儀器公司)，SK250H 超聲儀(上海科導超聲儀器有限公司)，TGL-16G 離心機(上海安亭科學儀器廠).

1.2 試藥與試劑

實驗所用試藥與試劑包括:AFT B1(批號，Pribolab STD#1041 1200823，25 μg/mL);玻璃濾紙為WhatmanTM(Diameter 110 mm);流動相中的甲醇和乙腈為色譜純(德國LiChrosolv);水為超純水，其余試劑均為分析純;脂必妥片(批號，S120904、S120905、S120906)由成都地奧九鴻制藥廠提供.

2 方法與結果

2.1 色譜條件

實驗的色譜條件:十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇—乙腈—水(40∶ 18∶ 42)為流動相，流速為0.8 mL/min;采用柱后衍生法檢測，衍生溶液為0.05%的碘溶液(取碘0.5 g，加入甲醇100 mL 使溶解，用水稀釋至1 000 mL 制成)，衍生化泵流速為0.3 mL/min，衍生化溫度70 ℃;以熒光檢測器檢測，激發(fā)波長λex 為360 nm，發(fā)射波長λem 為450 nm.

2.2 對照品溶液的制備

精密量取AFT B1 對照品(25 μg/mL)0.4 mL，置100 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液.精密量取儲備液1 mL，置500 mL 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得對照品溶液(每1 mL AFT B1 為0.2 ng).

2.3 供試品溶液的制備

取脂必妥片40 片，研細，精密稱取5.0 g，加入氯化鈉4 g，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(250W，40 kHz)20 min，放冷后再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，離心3 min(5 000r/min)，精密量取上清液5 mL，置25 mL 量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用玻璃纖維濾紙濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，通過免疫親和柱(AflaT-est@P)，流速為3 mL/min，用10%甲醇溶液洗滌燒杯和針筒等，將洗液過柱，再用水10 mL洗脫(流速為4.0 mL/min)，棄去洗脫液，吹氣除去柱中水滴，再用1.5 mL 甲醇，以每秒1 滴的速度洗脫，收集洗脫液，置2 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得供試品溶液.

2.4 檢出限測定

取“2.2”項下AFT B1 對照品溶液1 mL 至10 mL 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得每1 mL AFT B1 為0.02 ng，進樣4 μL，計算信噪比與進樣濃度，測得其檢出限為，0.5 μg/kg.

2.5 線性關系考察

精密吸取AFT B1 對照品溶液，分別依次進樣4、8、10、12、16、20 μL，測定色譜峰面積.將AFT B1 的色譜峰面積(Y)與進樣量(X)回歸，其回歸方程為，

Y=5.6481 ×107X－8.2347 ×103，r=0.9999

故方法的線性范圍為，0.0008 ng ～0.004 ng.

2.6 精密度實驗

精密吸取AFT B1 對照品溶液(0.2 ng·mL－1)10.0 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)重復進樣6次，計算儀器精密度，其RSD 為0.80%.

2.7 重復性實驗

精密稱取同一批號(S120904)的脂必妥片供試品6 份，按“2.3”項下供試品的制備方法平行操作，進樣分析，記錄峰面積，其RSD 為1.05%.

2.8 穩(wěn)定性實驗

精密吸取對照品溶液(0.2 ng·mL－1)于0、2、6、8、10、12 h 分別進樣10.0 μL，記錄峰面積，其RSD 為0.94%.

2.9 回收率實驗

精密稱取已知含量(0.6 ng·g－1)的脂必妥片，約2.5 g，按1∶ 1 的比例分別加入一定量的AFT B1對照品，按“2.3”項下的方法制備成供試品溶液，依法測定并計算加樣回收率，結果見表1.

表1 回收率的測定結果

2.10 樣品測定

采用標準曲線法計算含量，取供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，從隨行標準曲線中計算出含量，結果見表2.

表2 樣品測定結果(n=3)

3 討 論

3.1 提取溶劑

AFT B1 易溶于帶極性的溶劑而不溶于非極性溶劑中，一般采用幾種有機溶劑中加入少量水可以增強有機溶劑對樣品的滲透力.實驗比較了甲醇—水、乙腈—水、丙酮—水和三氯甲烷等幾種溶劑，均得到較高的回收率，其中以甲醇—水(80∶ 20)和丙酮—水(85∶ 15)提取效果最好，考慮到甲醇—水的適應性更廣，選擇前者作為樣品的提取溶劑.

3.2 提取溶劑與樣品量比例

實驗比較了溶劑量/樣品量分別為4∶ 1、8∶ 1 和10∶ 1，結果顯示，溶劑量/樣品量為10∶ 1 提取效率最高，樣品干擾雜質最少，可以基本達到提取完全.

3.3 樣品凈化除雜

實驗發(fā)現(xiàn)，樣品過柱時，流速對回收率結果影響較大，經比較樣品過柱流速為3.0 mL/min，水洗滌柱子流速為4.0 mL/min，能滿足回收率測定要求;另樣品液過柱后再用10%甲醇溶液洗滌燒杯和針筒等，將洗液一并過柱，能提高測定結果.

3.4 實驗中應注意的事項

實驗過程盡量避免日光照射.樣品溶液采用玻璃纖維濾紙濾過.經過水洗滌后的柱子，甲醇洗脫前，柱子中水滴的殘留對測定結果有較大影響.

［1］劉艷麗，程安春，汪銘書.黃曲霉毒素及其檢測方法的研究進展［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006，49(6):15－17.

［2］黃惠明，徐群英，胡敏.黃曲霉毒素檢測方法研究的概述［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2001，11(4):510－512.

［3］楊一剛.黃曲霉毒素B1 測定方法的探討［J］.科技情報開發(fā)與經濟，2004，14(8):168－169.

［4］柳潔，何碧英.黃曲霉毒素高效液相色譜檢測方法研究進展［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，7(15):891－896.