液質聯用分析金錢草醇提物中的化學成分

汪 丹，蔡 甜，吳志軍，謝萬霓，鄒 亮

(1.成都大學 基礎醫學與護理學院，四川 成都 610106;2.四川大學 華西藥學院，四川 成都 610041;3.中國科學院 成都有機化學所，四川 成都 610041;4.中國科學院 成都生物研究所，四川 成都 610041;5.四川省醫學科學院·四川省人民醫院，四川 成都 610072)

0 引 言

金錢草是一種常見中藥材，它為報春花科植物過路黃的干燥全草.中醫認為，金錢草主治濕熱黃疸、癰腫疔瘡等癥［1］.研究表明，金錢草含有多種化學成分，如黃酮、酚酸、萜類等［2－4］.中藥材的成分組成和含量與藥材產地及生長周期密切相關，傳統的分離純化鑒定方法費時費力，且存在大量已知的化學成分被多次重復分離的問題，而分離所消耗的原藥材和試劑的用量大，不便于快速篩選不同產地之間金錢草的化學成分的差異及尋找未報到的新化合物［5－6］.此外，傳統的高效液相色譜法在缺乏對照品時，難以對所檢測到的色譜峰提供有效的檢測信息，故需要用一種靈敏度高、專屬性好的分析方法對天然產物的成分來進行快速準確檢測［7－8］.目前，已有文獻記錄采用液質聯用的方式分析天然產物的化學成分，依靠質譜檢測到準分子離子峰或碎片離子峰并進行分析，能快速獲取分子式及結構信息，并經過鑒定得到其化學成分［9］.在此基礎上，本研究建立了一種LC-ESI-MS(Q-TOF)方法，來對野生采集的金錢草進行定性檢測分析.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材 料.

金錢草采集于四川省資陽市雁江區，經中國科學院成都生物研究所顧建教授鑒定為報春花科植物過路黃的全草.

1.1.2 試 劑.

實驗所用試劑包括:甲醇(Fisher Scientic Pittsburgh，PA，USA)，無水乙醇(成都市科龍化工試劑廠)，蒸餾水.

1.1.3 儀 器.

實驗所用儀器包括:Agilent 1100 系列高效液相色譜儀(四元泵、二極管陣列檢測器、自動進樣器和柱溫箱使用)(美國安捷倫儀器公司)，Bruker micrOTOF-Q 質譜儀(德國布魯克道爾頓儀器公司)，FW-100型高速萬能粉碎機(北京中興偉業儀器有限公司)，SHIMADZU AUX120 萬分之一電子天平(日本島津儀器公司)RE2000 型旋蒸揮發儀(上海雅榮儀器公司).

1.2 方 法

1.2.1 金錢草粗提物的制備.

稱取金錢草粉末(1.000 g)，精密稱定，置于50 mL 圓底燒瓶中，加入25 mL 80%乙醇溶液，浸漬24 h 后，于50 ℃超聲提取30 min，過濾;藥渣再加25 mL 80%乙醇，超聲提取1 次，過濾;合并兩次提取的濾液，于40 ℃下減壓回收制備金錢草粗提物.

1.2.2 空白樣品制備.

同“1.2.1”項下制備方法，不加藥材，制備得空白樣品.

1.2.3 樣品及空白樣品溶液的制備.

將“1.2.1”項和“1.2.2”項制備的金錢草粗提取物和空白樣品，用2 mL 80%乙醇溶液超聲15 min溶解，離心(12 000 r/min)，取上清液，制得樣品和空白樣品溶液，待LC-MS 測定分析.

1.2.4 色譜條件.

色譜柱為，Inertsil ODS-4(C18 柱，5μm 4.6 mm×250 mm，Inertsil ODS-4 GL Sciences Inc)，柱溫30℃.二元線性梯度洗脫，流動相為，A 相［水(1‰甲酸)］、B 相(甲醇).梯度為:0 ～2 min 100%A;6 min 92%A 8%B;8 min 65%A 35%B;10 min 50%A 50%B;14 min 40% A 60%B;20 min 30%A 70%B;26 min 20%A 80%B;32 min 10%A 90%B;52 min 6%A 94%B;62～80 min 100%B.流速為0.8 mL/min，進樣量為20 μL.

1.2.5 質譜條件.

質量分辨率為，10 ×103FWHM(半峰全寬)、922 u.氦氣用作碰撞氣體，高純度氮氣作為霧化器和干燥氣體的流速為0.5 L/min 和4.0 L/min.ESI源條件為:毛細管電壓為－4 500 V，端板電壓－4 000 V;毛細管出口電壓120 V，干燥氣體的溫度180 ℃.將0.8 mL/min 的液相流出液，利用三通管分流去掉約93%后，再連接進入質譜進樣，采集二級質譜時，分別用15 eV、35 eV 的碰撞能量對樣品進行轟擊，以獲得碎片離子峰.同時，用布魯克指南針軟件(Data Analysis 處理4.0 軟件)對數據進行分析處理.

在實驗中，共檢測到295 個準分子離子峰，其中篩除掉空白樣品的離子峰、在一級質譜中出現的二級質譜碎片離子峰、糖類物質離子峰后，獲得能確定分子式的物質峰共計43 個.在檢測到的這43 種物質中，已有文獻報道的物質有12 個［2－8］，剩余的31個物質，在金錢草化學成分中未被報道過.本研究依據檢測到的這31 種化合物的分子量，首次報道確立了其分子式、結構特征，并依據結構特征峰，推論新發現黃酮類化合物2 個.所測到的43 種物質峰詳情見表1.

2 結果與討論

本研究利用LC-ESI-MS 方法檢測到的新化合物集中在圖1 中的14 min 到39 min 之間出現，其各峰的保留時間、測得的精確分子量、誤差、檢測到的準分子式、化合物分子式、結構推理等信息見表1.

圖1 一級質譜及二級質譜總離子流圖

表1 中，化合物4、6、8、10、11、14、15、16、17、18、19、25、27、31 的質譜二級碎片顯示其結構為黃酮類化合物，其中，化合物4 和化合物10 在已有的文獻中未被報道過，屬于第一次發現的新化合物，化合物25、27 用標準品對比確認為槲皮素和山奈酚，其余的化合物與化合物25 或化合物27 有相同的黃酮母核，故確定上述檢測化合物均為黃酮類化合物.因在負離子模式下能夠檢測到物質峰的化合物必須含有羧酸根或多羥基的結構，故化合物1、2、3、5、7、9、12、13、16、20、21、22、23、24、26、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43 均為酚類或酸類化合物，其中，化合物37、38、42 為不易打碎的鏈狀結構，故推論為脂肪酸.

3 結 語

利用LC-ESI-MS 分析方法可以快速而準確地對金錢草乙醇提取物進行分析.本研究通過對資陽產金錢草的相關分析，共檢測到化學成分43 種，其中除已有文獻報到的黃酮類組分12 種，還檢測到31 種未知化學組分，尤其是發現了該產地的金錢草中含有2 種未被報道過的黃酮類活性成分(化合物4 和化合物10).本研究表明，LC-ESI-MS 方法可為不同產地金錢草藥材化學成分的鑒定、有效成分的快速篩選與發現新的活性成分，提供一種有效的解決方案.

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［S］.北京:化學工業出版社，2010.

［2］沈聯德，姚福潤.金錢草化學成分的研究［J］.華西藥學雜志，1988，3(2):71－75.

［3］侯冬巖，回瑞華，李鐵純，等.金錢草化學成分的分析［J］.鞍山師范學院學報，2004，6(2):36－38.

［4］Sun D X，Dong L H，Guo P P，et al.Simultaneous detection of flavonoids and phenolic acids in Herba Lysimachiae and Herba Desmodii Styracifolii using liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］.Food Chem，2013，138(1):139－147.

［5］楊念云，段僉廒，李萍，等.金錢草中黃酮類化合物的分離與結構鑒定［J］.中國藥學雜志，2006，54(21):1621－1624.

［6］王宇杰，孫啟時.金錢草的化學成分研究［J］.中國藥物化學雜志，2005，16(6):357－359.

［7］閆婷.金錢草化學成分及質量標準研究［D］.沈陽:遼寧中醫藥大學，2007.

表1 新化合物的質譜數據信息及分子式

［8］高飛飛.金錢草的化學成分研究［D］.重慶:西南大學，2013.

［9］戴雨霖，于珊珊，張穎，等.葛花中異黃酮類化學成分的RRLC-Q-TOF MS/MS 研究［J］.高等學校化學研究，2014，35(7):1396－1402.