正交試驗(yàn)法優(yōu)選白術(shù)多糖的提取工藝

袁海梅，李鴻翔，彭 騰

(1.成都大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 成都 610106;2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 教育部中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 610075)

0 引 言

白術(shù)多糖為白術(shù)的重要組成成分，研究發(fā)現(xiàn)，其具有多種藥理作用:增強(qiáng)大鼠神經(jīng)細(xì)胞抗氧化能力及減少DNA 損傷［1］;可減輕自體肝移植大鼠肝臟缺血再灌注損傷［2］;對(duì)腺嘌呤誘發(fā)的慢性腎功能衰竭的大鼠腎臟具有一定的保護(hù)作用［3］;可以促進(jìn)人外周血來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表型及功能的成熟［4］;對(duì)嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、植物乳桿菌的促生長(zhǎng)效果最佳，具有良好的促生長(zhǎng)效果［5］;通過(guò)降低凋亡基因及蛋白的產(chǎn)生，上調(diào)抗凋亡基因及蛋白的產(chǎn)生，提高Bcl-2/Bax 的比值達(dá)到抗神經(jīng)細(xì)胞缺氧性凋亡作用［6］.為了更好地開(kāi)發(fā)利用白術(shù)這一植物資源，本研究以白術(shù)多糖收率為考察指標(biāo)，以煎煮次數(shù)、煎煮時(shí)間、煎煮倍數(shù)為考察因素，采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選白術(shù)多糖的最佳提取工藝，擬為白術(shù)多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù).

1 儀器與材料

1.1 儀 器

試驗(yàn)所用儀器包括:RE-2000B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏義予華儀器有限責(zé)任公司)，馬頭牌JYT-2型架盤(pán)藥物天平(上海醫(yī)用激光儀器廠)，UV-1100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)，ZDZ5-WS 型離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司).

1.2 材 料

葡萄糖購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品鑒定所(批號(hào)，110833－200503);白術(shù)飲片購(gòu)于四川新荷花藥材飲片有限公司(批號(hào)，0907034)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)蔣桂華教授鑒定為正品;實(shí)驗(yàn)所用溶劑均為分析純.

2 方 法

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［7－9］

根據(jù)藥材提取過(guò)程中的影響因素，選定煎煮次數(shù)(A)、煎煮時(shí)間(B)和煎煮倍數(shù)(C)3 個(gè)因素為考察指標(biāo)，以精制多糖的收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，不考慮各因素的相互影響.因素與水平設(shè)計(jì)如表1 所示.

表1 試驗(yàn)因素水平表

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取葡萄糖對(duì)照品0.05134 g，加蒸餾水定容至50 mL，精密吸取5 mL 置50 mL 容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，制得對(duì)照品溶液.

2.3 供試品溶液制備

稱取白術(shù)藥材粗粉30 g，按正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，煎煮，合并水煎液，抽濾，濾液減壓濃縮至100 mL，加入85%的乙醇調(diào)節(jié)至60%，放置24 h，以3 500 r/min 離心10 min，得白術(shù)粗多糖，采用95%的乙醇、丙酮依次洗滌，減壓干燥24 h，即得粗多糖.精密稱取白術(shù)粗多糖0.2 g，置于100 mL 容量瓶中，加入蒸餾水，沸水浴中加熱30 min 溶解，放至室溫，定容至刻度.精密吸取10 mL，置100 mL 容量瓶中，搖勻，定容至刻度，制得供試品溶液.

2.4 多糖溶出率

精密吸取供試品溶液0.6 mL 于具塞試管中，精密吸取0.4 mL 蒸餾水于具塞試管中，立即加入蒽酮試劑4.0 mL，沸水浴中煮沸10 min，冰浴冷卻至室溫，測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖溶出率，其計(jì)算公式為，

3 結(jié) 果

3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制一系列不同濃度的葡萄糖溶液，在620 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定各試管中溶液的吸光度A.以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖含量(μg)為橫坐標(biāo)，以吸光度A 為縱坐標(biāo)，回歸方程為，

y=0.0054x+0.1094，R2=0.9998

結(jié)果表明，其在20.52 ～102.6 mg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果如表2 所示.

表2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性關(guān)系

3.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一份對(duì)照品溶液，按供試品制備方法制備，測(cè)定其6 次吸光度A，計(jì)算RSD.結(jié)果顯示，RSD=3.05%(n=6)，表明方法的精密度良好.

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液，按供試品制備方法制備6 份，測(cè)定吸光度A，計(jì)算白術(shù)藥材多糖溶出率，求得RSD=2.25%(n=6)，表明方法的重現(xiàn)性良好.

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液，按供試品制備方法制備，測(cè)定吸光度A，每30 min 測(cè)定1 次，連續(xù)2 h，求得RSD=1.47%(n=5)，表明方法的穩(wěn)定性良好.

3.5 加樣回收率

精密量取1 號(hào)供試品溶液0.5 mL，6 份，精密加入0.2 mL 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，0.3 mL 蒸餾水，按供試品制備方法制備，測(cè)定吸光度A.結(jié)果顯示，加樣回收率平均值為94.57%，RSD=4.75%.

3.6 正交試驗(yàn)結(jié)果

精密吸取1 至9 號(hào)白術(shù)多糖溶液0.6 mL，按供試品制備方法制備，測(cè)定吸光度A，計(jì)算白術(shù)多糖溶出率.正交試驗(yàn)結(jié)果與顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表3、表4.

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 顯著性檢驗(yàn)

從表3 的正交試驗(yàn)結(jié)果可知，由煎煮次數(shù)(A)、煎煮時(shí)間(B)和煎煮倍數(shù)(C)3 組K 值得極差值來(lái)分析，各影響因素對(duì)多糖提取工藝的貢獻(xiàn)率大小依次為煎煮次數(shù)(A)、煎煮倍數(shù)(C)、煎煮時(shí)間(B).根據(jù)多糖溶出率，煎煮次數(shù)(A)的最佳水平3，煎煮時(shí)間(B)的最佳水平3，煎煮倍數(shù)(C)的最佳水平3.從表4 的方差分析結(jié)果，因素煎煮時(shí)間(B)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著，表明煎煮時(shí)間(B)對(duì)白術(shù)多糖提取工藝影響最強(qiáng)，因素煎煮次數(shù)(A)和煎煮倍數(shù)(C)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著，則煎煮次數(shù)(A)和煎煮倍數(shù)(C)對(duì)提取工藝影響一般，各個(gè)因素對(duì)白術(shù)多糖的提取工藝的影響程度為，煎煮時(shí)間(B)＞煎煮次數(shù)(A)＞煎煮倍數(shù)(C)，但從經(jīng)濟(jì)有效的角度出發(fā)，本研究選擇A2B3C2為最優(yōu)化工藝條件，即:提取次數(shù)為2 次，提取時(shí)間1.5 h，加水量為藥材的10 倍.3.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照最佳提取工藝A2B3C2制備3 批樣品，并測(cè)定樣品中白術(shù)多糖的含量，其結(jié)果見(jiàn)表5.結(jié)果表明，在該工藝條件下，白術(shù)多糖的溶出率高，工藝穩(wěn)定.

表5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

4 討 論

白術(shù)多糖作為白術(shù)的重要組成成分，毒性小，生物利用度高，具有明顯的免疫增強(qiáng)作用.目前，白術(shù)多糖已用于食品添加劑，以及作為臨床藥物用于恢復(fù)期腫瘤病人或化療時(shí)輔助應(yīng)用.為了更好地開(kāi)發(fā)利用白術(shù)這一植物資源，本研究采用正交設(shè)計(jì)的方法對(duì)白術(shù)多糖的提取工藝進(jìn)行了研究，得出了提取白術(shù)多糖的最佳提取工藝.結(jié)果顯示，本提取工藝合理，穩(wěn)定可行，可為白術(shù)多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考.

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