高效液相色譜法檢測鴨、鵝可食組織中乙氧酰胺苯甲酯殘留量

楊林　薄永恒　高迎春等

摘要：建立了鴨、鵝組織中乙氧酰胺苯甲酯殘留量檢測的高效液相色分析方法。試樣中殘留的乙氧酰胺苯甲酯用乙腈提取，濃縮后用正己烷-丙酮溶解殘余物，硅酸鎂固相萃取柱凈化，用甲醇洗脫，收集洗脫液作為試樣溶液供高效液相色譜測定。該方法在乙氧酰胺苯甲酯0.05～5.0 μg/mL的系列濃度范圍內均呈良好線性關系，相關系數（r）均大于0.990。肌肉樣品中乙氧酰胺苯甲酯的檢測限為20 μg/kg，定量限為50 μg/kg；肝、腎樣品中乙氧酰胺苯甲酯的檢測限為50 μg/kg，定量限為100 μg/kg；各組織樣品中平均添加回收率均為70 % ～110%，相對標準偏差（RSD）均小于20%。該方法具有簡便快捷、靈敏度高、定性準確等特點。

關鍵詞：鴨、鵝可食組織；乙氧酰胺苯甲酯；殘留；高效液相色譜

中圖分類號： O657.7+2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0265-03

乙氧酰胺苯甲酯化學名為4-乙酰胺基-2-乙氧基苯甲酸甲酯，系一種抗原蟲（球蟲） 藥，主要與某些抗球蟲藥合用作為抗球蟲藥的增效劑用于家禽飼料中，如與氨丙啉、氨丙啉與磺胺喹[XCZ1.tif]啉混合用于控制雞球蟲病，在國內養殖業應用廣泛。蛋雞在產蛋期禁用，休藥期為3 d。如果中間停止用藥，球蟲會再發育，故連續使用才有效果[1]。由于用藥時間較長，藥物必然在肉中殘留，被人食用后會直接危害人體健康，所以我國規定了嚴格的休藥期，雞在上市或開產前3 d必須停藥。由于科學知識的缺乏和經濟利益的驅使，畜牧業中不按國家規定濫用獸藥和超標使用獸藥的現象普遍存在，這不僅影響到廣大人民群眾的日常生活，而且隨著我國加入WTO，國內外貿易的頻繁往來，也嚴重影響到我國的出口創匯。

2002年發布的中華人民共和國農業部公告第235號《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規定乙氧酰胺苯甲酯在禽組織中的最高殘留限量為：肌肉500 μg/kg，肝和腎1 500 μg/kg。乙氧酰胺苯甲酯在雞體內不發生代謝，以藥物原型排出。農牧發[2001]38號文發布了動物源食品中乙氧酰胺苯甲酯殘留檢測方法——高效液相色譜法，但是該標準只適用于雞的肌肉、脂肪、肝臟、腎臟組織中的乙氧酰胺苯甲酯殘留量的檢測。因此，我們對鵝、鴨的肌肉、肝和腎組織中的乙氧酰胺苯甲酯殘留的檢測方法做了研究。本試驗在已有的適用于雞組織中的乙氧酰胺苯甲酯標準[2]的基礎上，改進提取步驟，用高效液相色譜法檢測，使得試驗操作簡單、易行、耗時少。該方法具有操作簡單、檢測限低、重現性好、測定費用低的特點，適用于定量檢測動物性食品中乙氧酰胺苯甲酯的殘留量。

1 材料和方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀（配紫外檢測器）（Waters公司）；MP200B天平；臺式高速冷凍離心機（貝克曼公司）；R-200旋轉蒸發儀（潤濕BUCHI）；固相萃取裝置；XW-80A渦旋混合器（上海精科實業有限公司）；HY-4調速多用振蕩器。

1.2 試劑

乙氧酰胺苯甲酯對照品：含量≥98.5%（Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈、甲醇為色譜純（Fisher公司）；正己烷、丙酮、無水硫酸鈉（分析純）；試驗用水均為超純水。

1.3 標準溶液配制

1.3.1 乙氧酰胺苯甲酯標準儲備液（100 μg/mL） 稱取乙氧酰胺苯甲酯對照品10.0 mg（精確到0.1 mg），用甲醇溶解并定溶至100 mL，置4 ℃儲存，有效期為1周。

1.3.2 標準工作液 量取標準儲備液適量，用甲醇稀釋成濃度分別為5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.10、0.05 μg/mL的對照溶液，供高效液相色譜分析，臨用前配制。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品前處理

1.4.1.1 提取

稱?。?.00 ± 0.05） g勻漿試樣，置于 50 mL 具塞離心管中，加入乙腈15 mL，無水硫酸鈉10 g，正己烷10 mL，渦旋混合1 min，振蕩提取5 min，4 000 r/min離心10 min。用滴管吸取下層乙腈于雞心瓶中備用。向剩余沉淀物中再加入乙腈15 mL，重新提取1次，合并2次的乙腈提取液于同一雞心瓶中，于45 ℃下旋轉蒸發至近干。取正己烷-丙酮（9 ∶1）5.0 mL溶解上述殘留物，超聲30 s，搖勻，然后轉移至10 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，上清液備用。

1.4.1.2 凈化

硅酸鎂固相萃取柱用甲醇5 mL預洗。取上述上清液1.0 mL過柱，用正己烷3 mL淋洗，擠干。用甲醇1.0 mL洗脫，擠干，收集洗脫液，用0.45 μm的有機濾膜過濾后作為試樣溶液，供高效液相色譜測定。

1.4.2 色譜條件 色譜柱：C18柱，250 mm × 4.6 mm（i.d.）；流動相：乙腈-水（30 ∶70）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；進樣量：10 μL。

1.4.3 標準曲線的繪制 配制濃度為0.05、0.10、0.25、050、1.0、2.5、5.0 μg/mL的系列標準溶液，高效液相色譜測定后，乙氧酰胺苯甲酯峰面積為縱坐標，相應濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數。

1.4.4 靈敏度 在空白鵝、鴨的肌肉組織中添加乙氧酰胺苯甲酯對照溶液，按確定的提取凈化方法處理后，經高效液相色譜檢測，計算信噪比。

1.4.5 準確度與精密度 采用標準加入法，在鵝、鴨的組織中添加不同濃度乙氧酰胺苯甲酯進行回收率試驗。各濃度進行5個平行試驗，重復3次，求批內、批間相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 標準曲線endprint

標準工作曲線（圖1）回歸方程為：y=45 828x+177.61，r為0.999 9。

3 討論

3.1 樣品前處理條件的優化

本試驗對徐士新等的提取方法[2]進行優化改進。修訂后的方法，在組織殘留提取時，同時加入乙腈、無水硫酸鈉和正己烷進行提取，去掉了勻漿、過濾、靜置3個步驟，使耗材減少、操作更簡單、減少了提取過程的的損失（降低了樣品的檢測限和定量限），節省了時間，使用修訂后的方法進行添加回收測定試驗，結果回收率均在80%以上。

3.2 色譜方法的優化

液相方法首先通過色譜掃描確定檢測波長為270 nm時，信號強度最高[4]；采用優化流動相乙腈與水的配比，發現在30 ∶70的條件下獲得的峰形最好；流速采用常用的 1.0 mL/min。綜合以上色譜優化條件，可以獲得良好的試驗結果。

4 小結

本方法采用乙腈提取、硅酸鎂固相萃取柱凈化，高效液相色譜法測定，成功建立了動物性食品中乙氧酰胺苯甲酯的殘留檢測方法。在鵝、鴨的肌肉中乙氧酰胺苯甲酯的檢測限為20 μg/kg，最低定量限為50 μg/kg。在鵝、鴨的肝臟、腎臟中乙氧酰胺苯甲酯的檢測限為50 μg/kg，最低定量限為 100 μg/kg。整個試驗過程簡單、快速，回收率較高，適用于動物性食品中乙氧酰胺苯甲酯殘留的定量檢測。

參考文獻：[HJ1.4mm]

[1]丁佳雯，翁亞彪，朱建榮. 乙氧酰胺苯甲酯等藥物防治雞盲腸球蟲病的療效試驗[J]. 養禽與禽病防治，2004（10）：2-3.

[2]徐士新，仲 鋒，郭文林. 乙氧酰胺苯甲酯在雞組織中殘留的檢測及消除規律的研究[J]. 中國獸藥雜志，1999（3）：6-11.

[3]農業部. 獸藥殘留試驗技術規范（試行）[S]. 1999：6-11.

[4]Taahashi Y，Sekiya T，Nishikawa M，et al. Simultaneous high-performance liquid chromatographic determination of amprolium，ethopabate，sulfaquinoxaline and N4-acetylsulfaquinoxaline in chicken tissues[J]. Journal of Liquid Chromatography，1994，17（20）：4489-4512.endprint