超大劑量甲潑尼龍治療實驗性變態反應性腦脊髓炎的療效分析

危智盛 黃葉青 刁勝朋 洪銘范

超大劑量甲潑尼龍治療實驗性變態反應性腦脊髓炎的療效分析

危智盛 黃葉青 刁勝朋 洪銘范

目的 研究超大劑量甲潑尼龍（MP）對實驗性變態反應性腦脊髓炎（EAE）大鼠的治療作用，探討超大劑量MP能否提高療效。方法 構建EAE大鼠模型，分為超大劑量組、小劑量組和模型對照組，分別予以尾靜脈注射MP100mg/kg、25mg/kg、等體積生理鹽水；另取正常大鼠為正常對照組，給予等體積生理鹽水注射。連續給藥5d，處死大鼠，采血檢測血漿白細胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量。取腦、脊髓組織行HE染色及髓鞘染色。對臨床評分、炎性病灶計數、髓鞘脫失評分、細胞因子含量等進行綜合評價。結果 超大劑量組和小劑量組大鼠經MP治療前后臨床評分差異均有統計學意義(P<0.05)，組織炎性病灶數、髓鞘脫失評分及血漿IL-2、TNF-α含量均較模型對照組低。而超大劑量、小劑量組間在臨床評分、炎性病灶數、髓鞘脫失評分、細胞因子含量等方面比較均無統計學差異。結論 兩種劑量MP均能緩解EAE癥狀，改善病情，但臨床療效并不與劑量呈依賴性，在一定的有效劑量范圍內，超大劑量MP并不能提高療效。

甲潑尼龍；實驗性變態反應性腦脊髓炎；糖皮質激素；白細胞介素-2；腫瘤壞死因子-α

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種中樞神經系統（central nervous system，CNS）炎癥性、脫髓鞘性自身免疫性疾病。對于MS急性發作和復發，循證醫學A級證據推薦使用大劑量甲潑尼龍（methylprednisolone，MP）短程沖擊治療[1-2]。然而，目前MP使用劑量尚不統一，有學者認為2000mg/d MP沖擊治療MS，在一定程度上可優于500mg/d及1000mg/d[3-4]。也有研究表明大劑量與小劑量MP治療MS在臨床療效上比較并無顯著差異[5]。因此，目前臨床醫生常根據臨床經驗采用500mg/ d、1000mg/d或2000mg/d MP沖擊治療MS。由于使用大劑量糖皮質激素（glucocorticoid，GC）治療同時可造成嚴重不良反應，因此，選擇恰當的有效劑量是臨床醫生迫切關注的問題。目前相關的實驗論證不多，且針對GC治療MS或MS動物模型─實驗性變態反應性腦脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）的量效關系的研究甚少。本研究擬通過超大劑量MP對EAE大鼠進行沖擊治療，從臨床評分、病理改變、細胞因子等多個角度觀察，比較其與小劑量MP的療效差異，探討MP的量效關系，以證實超大劑量MP是否能提高療效，為臨床選擇恰當的GC劑量治療MS提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 雌性Wistar大鼠，6～8周齡，體質量180～200g；豚鼠，雌雄不限，體質量350～400g，購自南方醫科大學醫學實驗動物中心。注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（輝瑞公司）；白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）放射免疫檢測試劑盒購自北京華英生物技術研究所。

1.2 EAE模型制備 參照文獻[6]方法制備EAE模型。免疫接種后，每日觀察大鼠反應，包括進食、體質量、行動等情況，并參照Becher的標準[7]對大鼠神經損害表現進行臨床評分：正常或無任何神經缺損癥狀計為0分；尾巴遠端無力計0.5分；尾巴完全無力計1分；尾巴無力并后肢無力計1.5分；單側后肢部分癱瘓計2分；雙側后肢部分癱瘓計2.5分；雙側后肢完全癱瘓計3分；雙后肢完全癱瘓并有一側前肢癱瘓計3.5分；四肢癱瘓計4分；瀕臨死亡狀態或死亡計5分。大鼠評分≥1分即為臨床發病。

1.3 實驗分組及給藥 將EAE大鼠隨機分成3組，分別為：（1）超大劑量組：8只，給予MP 100mg/kg，生理鹽水稀釋后自尾靜脈注射；（2）小劑量組：8只，MP 25mg/kg，生理鹽水稀釋后自尾靜脈注射；（3）模型對照組：7只，給予等體積生理鹽水尾靜脈注射；(4)另取5只未經造模的正常Wistar大鼠在同等條件下飼養作為正常對照組，給予等體積生理鹽水尾靜脈注射。在免疫接種第12天大鼠發病后開始給藥，每天給藥1次，連續給藥3d后，MP減半量再給藥2d，共給藥5次。

1.4 血IL-2、TNF-α測定 給藥5d后，各組大鼠于第6天進行臨床評分，處死后剪斷頸部血管，采血約2mL/只，入EDTA抗凝管，離心后提取血漿約1mL，-20℃保存。按照IL-2、TNF-α放免試劑盒操作步驟，應用中國科學技術大學科技實業總公司生產的GC-911γ放射免疫計數器檢測大鼠血漿IL-2、TNF-α含量。

1.5 HE染色及髓鞘染色 取大鼠大腦視交叉層面2mm腦組織、小腦、腦干、脊髓頸膨大、腰膨大等部分，以4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、切片，并進行HE染色及砂羅鉻花青法（solochrome cyanin）髓鞘染色，光鏡下觀察腦、脊髓組織的形態學改變。對脊髓HE染色切片進行炎性病灶計數，參照標準[8]：呈袖套樣改變或者超過15～20個炎性細胞浸潤者記為1個炎性病灶。對脊髓組織髓鞘染色切片進行髓鞘脫失評分，參照評分標準[9]：（1）軟脊膜下少量脫髓鞘改變，計1分；（2）軟脊膜下和血管周圍明顯的脫髓鞘，計2分；（3）軟脊膜下或血管周圍見脫髓鞘斑塊融合，計3分；（4）軟脊膜下和血管周圍見廣泛的脫髓鞘并累及一半的脊髓，同時伴有中樞神經系統實質內炎性細胞的浸潤，計4分；（5）廣泛的軟脊膜下和血管周圍脫髓鞘并累及整個脊髓橫斷面，伴有中樞神經系統實質內的炎細胞浸潤，計5分。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統計分析，計量資料數據以“x±s”表示；治療前后臨床評分采用Wilcoxon秩檢驗，2組間的臨床評分、髓鞘脫失評分采用Mann-Whitney u檢驗；多組間炎癥病灶計數以及細胞因子含量的比較采用單因素方差分析，多組均數的兩兩比較采用LSD-t檢驗進行分析。

2 結果

2.1 臨床評分比較 免疫誘導后，大鼠在第10天開始陸續發病，表現為進行性體質量下降、尾巴張力減退，繼而尾巴無力，并可出現后肢及四肢無力、麻痹，伴有大小便失禁。超大劑量組和小劑量組大鼠經MP治療后神經損害癥狀均得到明顯改善，而模型對照組大鼠癥狀無改善，且部分大鼠癥狀加重。治療組臨床評分下降(P<0.05)，而模型對照組評分加重(P<0.05)。超大劑量組與小劑量組治療前后臨床評分改變的差值比較，差異無統計學意義。見表1。

表1 EAE大鼠臨床評分、炎性病灶數、髓鞘脫失評分比較（x±s）

2.2 炎性病灶數比較 EAE大鼠腦、脊髓組織HE染色鏡下可見小血管充血、血管壁增厚、內皮細胞破壞，血管周圍可見大量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主，形成典型的“袖套樣（cuffing）”改變。而正常對照大鼠腦和脊髓均無異常。對脊髓切片中炎性病灶數進行比較，可見超大劑量組和小劑量組病灶計數顯著較模型對照組減少（P<0.001），但超大劑量組與小劑量組之間比較病灶計數無統計學差異。

2.3 髓鞘脫失比較 砂羅鉻花青法染色在光鏡下可見髓鞘呈藍色，膠原纖維呈粉紅色，細胞核呈深藍色，EAE大鼠脊髓組織可見髓鞘均有不同程度脫失。超大劑量和小劑量組髓鞘脫失評分均較模型對照組低（P<0.05），但超大劑量組與小劑量組間進行比較評分差異無統計學意義。

2.4 細胞因子比較 模型對照組大鼠血漿IL-2和

TNF-α含量均較正常對照組高(P<0.01)；超大劑量組與小劑量組IL-2、TNF-α含量均較模型對照組低（P<0.05），但IL-2與正常對照組比較，差異無統計學意義，TNF-α仍高于正常水平，與正常對照組比較，差異有統計學意義（P<0.01）。超大劑量組與小劑量組間IL-2、TNF-α含量進行比較，差異均無統計學意義。見表2。

表2 各組大鼠血IL-2、TNF-α含量比較（ng/mL，x±s）

3 討論

EAE是一種由特異性致敏的CD4+T細胞介導的，以CNS內小血管周圍單個核細胞浸潤及髓鞘脫失為主要特征的自身免疫性疾病[10]。其病理生理改變與人類MS極為相似，是目前國內外研究MS發病機制及實驗性治療的最適宜模型[11]。GC可以通過誘導T細胞凋亡，下調T細胞粘附分子及調節T細胞遷移等機制達到治療EAE的作用[12]。研究已表明，EAE的病理變化與其病情的嚴重程度基本一致[13]。在MS及EAE，由于Th1細胞的過度活化，其表達的IL-2及TNF-α水平增高，而且其增高的程度可與疾病的嚴重程度相平行[14]。因此，我們從臨床評分、炎性病灶數、髓鞘脫失評分、細胞因子等多個角度來比較超大劑量MP與小劑量MP對EAE病情改善的差異，探討超大劑量MP能否優于小劑量MP，為臨床優化GC治療MS提供一定的實驗依據。

本實驗表明，超大劑量和小劑量MP治療后，EAE大鼠神經損害癥狀均得到顯著的改善，治療前后臨床評分比較，差異有統計學意義；超大劑量和小劑量組炎性病灶計數、髓鞘脫失評分、細胞因子IL-2和TNF-α含量均較模型對照組低。表明兩種劑量MP均能緩解EAE癥狀，改善病情，縮短病程。然而，無論是從臨床評分、炎性病灶計數、髓鞘脫失評分及細胞因子含量等多個方面進行比較，超大劑量與小劑量組間差異無統計學意義。因此，臨床療效并不與劑量呈依賴性。我們認為，在一定的有效劑量范圍內，超大劑量MP尚不能提高療效。

Schmidt等[15]曾以50mg/kg、10mg/kg、1mg/kg MP等作為大、中、小劑量治療EAE大鼠，并分析其對T細胞凋亡的差異，結果表明，1mg/kg MP不能誘導T細胞凋亡，而50mg/ kg則優于10mg/kg。因此，我們采用25mg/kg作為為小劑量，100mg/kg為超大劑量，以此拉開劑量跨度，但結果并未發現這種兩種劑量在臨床評分、炎性病灶計數、髓鞘脫失評分及細胞因子含量等方面的療效存在差異。本研究分析考慮有以下幾點可能：（1）大鼠對藥物的耐受范圍較大。按照體表面積計算法對動物與人的劑量進行換算，大鼠每公斤體重劑量是人的6倍[16]。因此，在一定有效藥物濃度內，大鼠劑量與療效可能不呈依賴性。（2）糖皮質激素受體飽和。GC進入細胞漿后，與胞漿內GR的激素結合區結合，然后進入細胞核，啟動并調控某些具有一定生物學效應的多肽、酶、細胞因子等基因的轉錄，從而發揮免疫抑制、抗炎等效應[17-18]。因此，當GR飽和后，增大GC劑量亦無法提高GC的生物效應。（3）實驗樣本量不夠大。本實驗MP治療各組大鼠樣本量尚不夠大，可能在統計過程易出現偏差。對于MP劑量設計上也可能存在不足。以大鼠每公斤體重用藥劑量相當于人的6倍為標準，本實驗所用超大劑量100mg/kg MP，約相當于給予60kg體質量患者1000mg/d的MP沖擊治療，因此，今后我們還可以設計更大劑量MP，研究其對EAE大鼠的療效。GC對MS或EAE的作用機制非常復雜，劑量與療效關系的研究亦還有待更深入探討。

[1] Kamm CP,Uitdehaag BM,Polman CH.Multiple Sclerosis:Current Knowledge and Future Outlook[J].Eur Neurol,2014,72(3-4):132-141.

[2] 李夢秋，胡佳，司洋，等.多發性硬化治療措施的臨床證據評價[J].中國現代神經疾病雜志，2012，12（2）：152-157.

[3] Oliveri RL,Valentino P,Russo C,et al.Randomized trial comparing two different high doses of methylprednisolone in MS:a clinical and MRI study[J].Neurology,1998,50(6):1833-1836.

[4] Fierro B,Salemi G,Brighina F,et al.A transcranial magnetic stimulation study evaluating methylprednisolone treatment in multiple sclerosis[J].Acta Neurol Scand,2002,105(3):152-157.

[5] Miller DM,Weinstock-Guttman B,Béthoux F,et al.A meta-analysis of methylprednisolone in recovery from multiple sclerosis exacerbations[J]. Mult Scler,2000,6(4):267-273.

[6] Tian DH,Perera CJ,Apostolopoulos V,et al.Effects of vaccination with altered Peptide ligand on chronic pain in experimental autoimmune encephalomyelitis,an animal model of multiple sclerosis[J].Front Neurol,2013,4:168.

[7] Becher B,Durell BG,Noelle RJ.Experimental autoimmune encephalitis and inflammation in the absence of interleukin-12[J].J Clin Invest,2002,110(4):493-497.

[8] Sobel RA,Blanchette BW,Bhan AK,et al.The immunopathology of experimental allergic encephalomyelitis.I.Quantitative analysis of inflammatory cells in situ[J].J Immunol,1984,132(5):2393-2401.

[9] Zappia E,Casazza S,Pedemonte E,et al.Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis inducing T-cell anergy[J]. Blood，2005,106（5）：1755－1761．

[10] Klaren RE,Motl RW,Woods JA,et al.Effects of exercise in experimental autoimmune encephalomyelitis (an animal model of multiple sclerosis)[J].J Neuroimmunol,2014,274(1-2):14-19.

[11] Rangachari M,Kuchroo VK.Using EAE to better understand principles of immune function and autoimmune pathology[J].J Autoimmun,2013,45:31-39.

[12] Schweingruber N,Fischer HJ,Fischer L,et al.Chemokinemediated redirection of T cells constitutes a critical mechanism of glucocorticoid therapy in autoimmune CNS responses[J].Acta Neuropath ol,2014,127(5):713-729.

[13] 陸正齊，朱燦勝，鄭雪平，等.不同抗原誘導不同動物多發性硬化模型的比較[J].中山大學學報（醫學科學版）,2008,29(6):684-689.

[14] Monteiro de Castro G,Eduarda Zanin M,Ventura-Oliveira D,et al.Th1 and Th2 cytokine immunomodulation by gangliosides in experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Cytokine,2004,26(4):155-163.

[15] Schmidt J,Gold R,Sch?nrock L,et al.T-cell apoptosis in situ in experimental autoimmune encephalomyelitis following methylprednisolone pulse therapy[J].Brain,2000,123 (Pt7):1431-1441.

[16] Reagan-Shaw S,Nihal M,Ahmad N.Dose translation from animal to human studies revisited[J].FASEB J,2008,22(3):659-661.

[17] Quax RA,Manenschijn L,Koper JW,et al.Glucocorticoid sensitivity in health and disease[J].Nat Rev Endocrinol,2013,9(11):670-686.

[18] Gomez FP,Steelman AJ,Young CR,et al.Hormone and immune system interactions in demyelinating disease[J].Horm Behav,2013,63(2):315-321.

Objective To evaluate the therapeutic effects of super-high dose of methylprednisolone (MP) in experimental allergic encephalomyelitis (EAE), and to investigate whether a super-high dose of MP improves its efficacy. Methods EAE models were induced by Wistar rats, and then the EAE rats were randomly divided into three groups (super high-dose group, low-dose group, and model control group). Super highdose group and low-dose group were given MP at a dose of 100 and 25 mg/kg i.v., respectively. Model control group and normal control groups were injected with an equivalent volume of 0.9% saline solution. The rats were sacrificed after five consecutive days therapy, then the plasma concentrations of interleukin-2 (IL-2) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were measured by radioimmunoassay. Pathological feature and myelin of spinal cord was observed by HE staining and myelin staining respectively. The efficacy of super high-dose and low-dose MP was evaluated by analyzing clinical score changes, demyelination scores, inflammatory foci and the cytokine concentrations. Results The clinical scores of EAE rats in super high-dose and low-dose group after MP treatment were significantly lower than that before treatment, and the counts of inflammatory foci, scores of demyelination and concentrations of IL-2 and TNF-α in super high-dose and low-dose group were significantly lower than that in model control group. However, there were no significant differences in those aspects between super high-dose group and low-dose groups. Conclusion Both MP doses had similar therapeutic effects, but there is no dependent correlation between dosage and therapeutic effects, to some effective dose range, super high-dose of MP does not improve efficacy.

Methylprednisolone; Experimental allergic encephalomyelitis; Glucocorticoid; Interleukin-2; Tumor necrosis factor-α

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.16.001

廣東 510080 廣東藥學院附屬第一醫院神經內科 （危智盛 黃葉青 刁勝朋 洪銘范）