葡萄糖6磷酸異構酶和烯醇化酶1可預測人類精子冷凍復蘇后活力*

蔣旭平 王尚乾 王 巍 徐 楊 湯井源 徐 震 周偉民 張 煒**.南京醫科大學第一附屬醫院泌尿外科（南京 20029）；2.宜興市人民醫院泌尿外科

葡萄糖6磷酸異構酶和烯醇化酶1可預測人類精子冷凍復蘇后活力*

蔣旭平1，2王尚乾1王 巍1徐 楊1湯井源1徐 震1周偉民2**張 煒1**
1.南京醫科大學第一附屬醫院泌尿外科（南京 210029）；2.宜興市人民醫院泌尿外科

目的 比較葡萄糖6磷酸異構酶（GPI）和烯醇化酶1（ENO1）在人類精子中不同耐凍能力組之間表達的差異，尋找預測人類精子凍融后活力可能的標志物。方法 收集42例合格供精志愿者的新鮮精液樣品，依據凍融后精子活力的不同，將符合條件的樣品分為耐凍組和不耐凍組，應用蛋白質印跡（Western blot）技術比較兩組樣品GPI和ENO1蛋白在表達量上的差異，利用免疫熒光技術驗證Western blot結果并觀察兩種蛋白在精子中的分布。結果 在兩組樣品之間，GPI和ENO1都表現出明顯的差異。GPI和ENO1在耐凍組的表達量均高于不耐凍組（分別為P＜0.01，P＜0.05），而蛋白在精子中的分布未見明顯組間差異。結論 GPI和ENO1可以作為標志物在凍存前預測人類精子冷凍復蘇后的活力。

精液保存； 葡糖-6-磷酸異構酶； 磷酸丙酮酸水合酶

**共同通訊作者: 周偉民， E-mail: staff551@yxph.com； 張煒， E-mail: zhangwei@medmail.com.cn受能力的強弱還不能被成功預測，因此，精子庫的每個捐精志愿者需要先經過評估，合格捐精者的首要條件是精子質量正常和凍存后精子質量下降較少，并且凍融后的精子活力達到40%。如果尋找到精子耐凍性的標志物，捐精的過程將可以變得簡化而高效，減少不必要的資源浪費。為此，已有很多研究者致力于尋找在凍存前預測精子耐凍能力的標志物。

精子成熟度被認為是精子抵抗冷凍損傷的主要因素，但研究證明其在預測凍融后精子活力方面并沒有很大價值，而精子密度和正常形態率具有相對較好的預測作用［6，7］。精子活力是指精子向卵子的運動能力，包括線性和環繞運動，不論運動的速度［8］，這種形式的活力是決定精子授精成功率最重要的因素之一［9］。在精子冷凍領域，精子活力也被考慮為精子耐凍性可能的標志物。有研究報道，能夠預測精子冷凍成功性的一個指標是精子在離體后1h具有較高的活力（≥55%）并且大部分精子能夠前向運動［10］。

男科學領域中，蛋白組學技術得到廣泛應用，在尋找男性不育的標志物方面取得了一定的進展［11，12］。蛋白組學技術同樣被應用于動物研究中，并且已經尋找到一些蛋白可以作為預測凍融后精子活力的標志物，如頂體素結合蛋白（ACRBP）、磷酸丙糖異構酶（TPI）［13］和熱休克蛋白AA1 （HSP90AA1）［14］等。這些結果提示我們可以通過對冷凍前的人類精子樣品進行特定蛋白的測定，以尋找精子耐凍能力的標志物。

GPI和ENO1與精子活力有一定的相關性［15，16］，因此我們選取這兩個蛋白作為研究對象，尋找精子耐凍性可能的標志物。在這項實驗中，我們用蛋白質印跡（Western blot）技術比較耐凍組和不耐凍組中這兩種蛋白表達的差異，并用免疫熒光輔助驗證。

資料與方法

一、研究對象

本研究通過了南京醫科大學倫理委員會的批準并按照國家和國際準則執行。研究中的42例供精志愿者均來自南京醫科大學第一附屬醫院人類精子庫，為同批初篩者。42例志愿者的年齡為20～33周歲，平均年齡23.1周歲。所有供精者都簽署了知情同意書。按照要求，供精者在禁欲3～5d后通過手淫方式收集精液。樣品均按照第四版世界衛生組織（WHO）人類精液檢查和處理實驗室手冊中的實驗流程，在精子庫內接受臨床和實驗評估。我們用WLJY-9000型偉力彩色精子質量檢測系統測定精子密度及活力，精液合格的標準為精液量＞2mL；液化時間＜1h；精子密度＞20×106/mL；活力［（a級+b級）精子比率］＞60%；正常形態＞5%。液化的精液樣品與凍存保護劑混合后凍存7d，再進行下一步的研究。按照凍融后活力＞40%的標準，新鮮精子樣品被分為耐凍組（活力＞40%）和不耐凍組（活力≤40%）。

二、材料

超聲波破碎儀（Model 300，美國Fisher Scienti c公司）；電泳儀及凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；熒光顯微鏡（LSM 710，德國Carl Zeiss公司）；冷凍管（德國Greiner Bio-One公司）；BWW液購于美國GenMed Scientifics公司；1%蛋白酶抑制劑購于美國Thermo Scientific公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購于美國GE Healthcare公司；兔抗人GPI多克隆抗體購于美國Abgent公司；兔抗人ENO1多克隆抗體、小鼠抗人β-actin單克隆抗體購于美國Abcam公司；免疫熒光小鼠抗人GPI單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司；免疫熒光二抗購于美國Jackson公司。

三、精子冷凍和復蘇

每份新鮮精液樣品被分為3份，第一份進行常規冷凍復蘇過程，第二份用于精子蛋白的提取行Western blot檢測，第三份用于免疫熒光染色。我們將第一份的精子樣品與等量的10%甘油-卵黃冷凍液混合，然后將混合液轉移到冷凍管中并存入程序化冷凍室使溫度從20℃降到-80℃。隨后冷凍管被轉移到-196℃的液氮中保存7d。最后，精子樣品被置于恒溫器中37℃水浴7 min進行復蘇。

四、精子蛋白的提取

第二份的新鮮精子樣品完全液化后加入60% Percoll溶液洗滌，800 ×g，離心7 min，棄上清液，收集沉淀精子；BWW液洗滌2次，加入適量裂解液和1%蛋白酶抑制劑提取精子蛋白。精子用超聲波粉碎儀降解，20焦耳，2s×10次，間隔15s。樣品置于冰盒中1h并且每15min渦旋一次。然后樣品置于4℃，20 000×g，低溫離心1h去除雜質，蛋白濃度用染色法測定。所有樣品被轉移到凍存管保存于-196℃的液氮中。

五、Western blot檢測

按每孔50 μg 蛋白上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）120 V電壓下分離，再用30 V電壓將凝膠上的蛋白濕轉至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉2h，裁剪目的蛋白條帶后加入對應的一抗（兔抗人GPI多克隆抗體，1:200稀釋；兔抗人ENO1多克隆抗體，1:1000稀釋；小鼠抗人β-actin單克隆抗體，1:10 000稀釋。其中β-actin被用作內參），4℃孵育過夜。TBST洗膜3×10min，然后用辣根過氧化物酶標記的二抗（羊抗兔IgG或羊抗小鼠IgG，1:2000稀釋）孵育1h。TBST洗膜3次，最后用ChemiDoc XRS+成像系統曝光顯影，所得圖像均用Image Lab 軟件分析灰度值。

六、免疫熒光染色

第三份精子樣品加入PBS 300 ×g，離心5min后重懸，重復3次。接種于多聚賴氨酸處理后的無菌載玻片上，晾干后用4%多聚甲醛室溫固定1h，PBS洗滌3次。0.5% Triton X-100處理15min，洗滌后用1%牛血清室溫封閉2h，加入一抗（小鼠抗人GPI單克隆抗體，1:100稀釋；兔抗人ENO1多克隆抗體，1:200稀釋），4℃孵育過夜。PBS洗滌后加入二抗，室溫孵育1h。PBS洗滌4次，每次5min。熒光封片劑封片，避光4℃保存，熒光顯微鏡下觀察。

七、統計學分析

使用SPSS17.0統計軟件進行統計分析。所得數據均以均數±標準差標示，檢驗前均進行方差齊性和正態分布檢驗，均數間的比較采用獨立樣本 t 檢驗，P＜0.05視為差異具有統計學意義。

結 果

一、精子樣品的分組及參數分析

42份合格的樣品根據凍融后精子的活力和密度，27份樣品被歸類為耐凍組，另外15份歸為不耐凍組。凍融前兩組精子樣品的各項參數均沒有明顯差異（包括精液量、液化時間、精子密度、活力和正常形態率等）（表1）。凍融后，兩組間的活力差異具統計學意義（P＜0.01），而精子密度、正常形態率等沒有明顯差異（圖1-3）。

表1 冷凍前和冷凍后兩組精子參數比較（）

表1 冷凍前和冷凍后兩組精子參數比較（）

與耐凍組比較， * P為＜0.01

冷凍前 冷凍后耐凍組__________不耐凍組______ ______合計 耐凍組 不耐凍組 合計例數 27 15 42 27 15 42精液量（mL） 4.07±1.59 3.86±1.28 4.00±1.47 1.00 1.00 1.00液化時間（min） 26.63±6.23 26.80±5.19 26.69±5.81 26.63±6.23 26.80±5.19 26.69±5.81精子密度（M/mL） 156.52±50.1 146.34±65.9 152.89±55.7 60.26±21.2 60.55±20.6 60.37±20.7正常形態（%） 31.88±4.32 29.57±5.63 31.06±4.89 14.37±1.77 13.65±2.10 14.11±1.90 （a+b）級精子（%） 67.21±5.23 65.47±5.02 63.91±4.93 49.36±7.56 31.55±6.18* 43.00±11.13曲線速度VCL（μm/s） 56.85±7.64 53.86±7.13 55.78±7.52 52.94±6.70 50.21±4.28 51.96±6.04直線速度VSL（μm/s） 35.23±3.72 33.63±3.08 34.66±3.55 37.26±4.45 34.90±3.39 36.42±4.22平均路徑速度VAP（μm/s） 40.27±4.74 37.67±3.11 39.34±4.37 38.70±3.63 36.87±3.02 38.05±3.50平均移動角度MAD（°） 59.02±7.21 58.98±4.89 59.01±6.41 51.93±5.27 49.57±5.69 51.09±5.47側擺幅度ALH（μm） 4.79±1.00 4.63±0.80 4.74±0.93 3.62±0.88 3.30±0.45 3.51±0.76 __鞭打頻率BCF（Hz） 5.05±0.40_________5.22±0.37__________5.11±0.39_________ ______________________________________________ 5.00±0.37__5.22±0.39__5.08±0.38

圖1 凍融前后兩組精子密度的比較冷凍前和復蘇后， 兩組間精子密度均沒有差異， 但凍融明顯降低了各組的精子密度， **P＜0.01

圖2 凍融前后兩組精子正常形態率的比較冷凍前和復蘇后，兩組間精子正常形態率均沒有差異， 但凍融明顯降低了各組的精子正常形態率， ** P＜0.01

圖3 凍融前后兩組精子活力的比較** P＜0.01

二、Western印跡結果

兩個目的蛋白的分析均以β-actin為內參。GPI 和ENO1的標準化蛋白量在耐凍組和不耐凍組間有明顯的差異，兩者在耐凍組的表達均明顯高于不耐凍組（GPI和ENO1分別為P＜0.01，P＜0.05）（圖4，圖5）。

圖4 Western blot 檢測GPI及ENO1蛋白的表達

圖5 兩組精子GPI及ENO1蛋白表達量的比較*P＜0.05， **P＜0.01

以凍融后精子的活力作為評估精子耐凍性的指標，我們發現精子耐凍性和GPI的標準化蛋白量存在明顯正相關（r = 0.959；P＜0.01）；與ENO1的標準化蛋白量同樣呈正相關性（r = 0.926；P＜0.01）。

三、免疫熒光結果

結果顯示兩種蛋白在精子中具有不同的位置分布。根據免疫熒光，我們發現GPI主要定位于精子的尾部中段，即線粒體所在部位，而且在耐凍組中的表達量明顯高于不耐凍組；ENO1定位于精子尾部的中段和主段，其表達量在耐凍組也明顯高于不耐凍組（圖6）。免疫熒光結果證實了Western blot分析的正確性。

討 論

人類精子冷凍技術已有70多年的歷史，是將精子于-196℃或以下低溫保存的一種技術。在此溫度下，所有生命活動理論上都會停止，包括一些導致細胞死亡的生物化學活動。這為一些生殖系統有缺陷者、接受放化療者、少精和弱精者等提供了生育的機會。但是冷凍復蘇過程會對精子的DNA完整性、精子的活力和存活率等產生影響［3，4］，從而降低精子的生育力。很多研究者致力于尋找預測精子對抗凍存損傷能力的方法，并已取得一定的成果。本研究的主要目的是從蛋白方面尋找人類精子耐凍性可能的生物標志物。

我們根據凍融后精子的活力將新鮮精液中提取的蛋白樣品分為耐凍組和不耐凍組，對兩組樣品進行蛋白分析，檢測GPI和ENO1在兩組間表達的差異。Western blot技術顯示GPI和ENO1在耐凍組的表達均明顯高于不耐凍組，免疫熒光分析得到了相同結果，說明這兩種蛋白可以作為精子耐凍性的指標。以Western blot分析中的標準化蛋白量和精子耐凍性為參數做皮爾森相關性分析，結果顯示GPI和ENO1的表達量與精子耐凍性均存在正相關關系，說明了這兩種蛋白作為精子耐凍能力標志物的可靠性。

GPI是指葡萄糖6磷酸異構酶，又名磷酸己糖異構酶，是一種廣泛存在的胞質酶，在糖酵解和糖異生途徑中起關鍵作用，催化6磷酸果糖和6磷酸葡萄糖的相互轉化［17］，同時還具有其他重要的生理生化功能［18］。一些具有抗精子發生作用的化合物能抑制精子活力，并且降低睪丸中和精子中GPI的活性［16，19］，提示GPI活性與精子活力可能存在一定相關性。在哺乳動物的精子中，GPI是一種松散地結合于線粒體的可溶性酶［20］，很容易從精子中流失［21，22］。當經歷冷凍過程或處于低滲透壓的應激條件下，精子會釋放大量的GPI到胞外培養液中［23］，這可能是凍存對精子產生損傷的機制之一，最終導致精子活力降低。我們的結果顯示，耐凍組和不耐凍組的精子在冷凍前具有不同的GPI表達量，說明GPI是影響精子凍融后活力的一個重要因素，可以作為預測精子耐凍性的良好指標。

圖6 免疫熒光檢測GPI及ENO1蛋白的表達A，B分別為GPI在耐凍組和不耐凍組的免疫熒光成像；D，E分別為ENO1在耐凍組和不耐凍組的免疫熒光成像；C，F為陰性對照

ENO1即烯醇化酶1，也被稱為磷酸丙酮酸水合酶，是在哺乳動物中發現的3種烯醇化酶之一。它是糖酵解過程的中的一個關鍵酶，能夠催化2-磷酸甘油酸轉化為磷酸烯醇式丙酮酸［24］。在機體中，ENO1具有多種生物學功能，如促進肌生長、調控細胞凋亡以及腫瘤發生、調控纖溶活性等［25］。在成熟精子中，ENO1表達于精子的尾部，它通過調節酶的活性在微管中產生能量并可以保護精子免受氧化應激損傷［15］，在精子成熟的過程中，它還參與蛋白的轉錄后修飾［26］。Park等通過比較高生育率和低生育率公牛精子的蛋白表達，發現ENO1可能是精子生育力的一個理想標志物［27］。在我們的研究中，ENO1在耐凍組中的表達量明顯高于不耐凍組，而且，其表達量與精子耐凍性呈明顯的正相關性。這些結果提示，ENO1也可以作為精子耐凍性的理想標志物。

不管使用何種技術，冷凍復蘇都會對精子產生一定的損害。為了使凍存對精子質量的損傷最小化，我們需要做更多的研究來提高凍存技術。同時，我們可以尋找精子耐凍性的標志物，優化精子凍存的過程。在本研究中，我們分析凍存前精子的GPI和ENO1蛋白含量，證明了在未受冷凍影響的情況下，精子之間就存在GPI和ENO1表達量的差異，說明我們可以通過檢測這兩種蛋白來預測精子對冷凍損傷的抵抗能力。綜上所述，GPI和ENO1可以作為預測人類精子凍融后活力的標志物。

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（2015-03-24收稿）

Glucose-6-phosphate isomerase （GPI） and Enolase1 （ENO1）predict the motility of cryopreserved spermatozoa*

Jiang Xuping1，2， Wang Shangqian1， Wang Wei1， Xu Yang1，Tang Jingyuan1， Xu Zhen1， Zhou Weimin2**， Zhang Wei1**
1.Department of Urology， the First Af liated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing， 210029， China；
2.Department of Urology， Yixing People's Hospital

Zhou Weimin， E-mail: staff551@yxph.com； Zhang Wei， E-mail: zhangwei@medmail.com.cn

Objective To explore the probable biomarker of human sperm to predict the motility of cryopreserved spermatozoa. Methods 42 semen samples from 42 donors satisfied the minimal values of sperm quality before cryopreservation and were divided into good freezability ejaculates and poor freezability ejaculates according to progressive motility of the sperm after thawing. The level of glucose-6-phosphate isomerase （GPI） and enolase1 （ENO1） in semen samples from each group before cryopreservation were comparatively analyzed by western blot. Immunofluorescence staining was also performed for validation and distribution of GPI and ENO1. Results Levels of GPI （P＜0.01） and ENO1 （P＜0.05） in semen samples were both signi cantly higher in GFE than that in PFE. There was no difference in location of the two proteins in sperm between two groups. Conclusion GPI and ENO1 can be used as markers to predict sperm freezability before starting the cryopreservation procedure.

semen preservation； glucose-6-phosphate isomerase； phosphopyruvate hydratase

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.08.006

R 321.1

精子冷凍是保持精子無限期存活并保存男性生育力的一項技術，被廣泛應用于人類輔助生殖。這對于一些不能生育的病人非常重要，如需要接受放療和化療的癌癥病人、生殖器有缺陷的病人和少精、弱精的病人等［1，2］。但是，冷凍復蘇過程會對精子的功能和生育能力產生影響［3-5］。迄今為止，精子對冷凍耐

資助: 國家自然科學基金面上項目（81370781）