癃暢顆粒對大鼠前列腺增生組織凋亡調控基因fas表達的影響*

楊珊珊 安立文 柳文宏. 黑龍江中醫藥大學研究生（哈爾濱 50040）；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院泌尿外科； . 江蘇淮安市第四人民醫院

癃暢顆粒對大鼠前列腺增生組織凋亡調控基因fas表達的影響*

楊珊珊1安立文2**柳文宏3
1. 黑龍江中醫藥大學研究生（哈爾濱 150040）；
2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院泌尿外科； 3. 江蘇淮安市第四人民醫院

目的 通過癃暢顆粒對大鼠前列腺增生組織凋亡調控基因fas表達的影響，探討癃暢顆粒治療前列腺增生的作用機制。方法 Wistar雄性大鼠120只，隨機平均分為癃暢顆粒高、中、低劑量組，癃閉舒組，模型組和正常組6組，每組20只。除正常組外，其余各組采用大鼠去勢后注射Testosterone Propionate（丙酸睪酮）至前列腺增生法造模，各組均灌胃給藥30d后處死，摘取前列腺組織測量濕質量，計算前列腺指數，采用免疫組化PV法檢測實驗鼠前列腺增生組織Fas表達狀況。結果 （1）前列腺濕重：正常組（0.62±0.91）g；模型組（0.92±0.50）g；癃閉舒組（0.75±0.58）g；癃暢顆粒低劑量組（0.80±0.92）g；癃暢顆粒中劑量組（0.79±0.10）g；癃暢顆粒高劑量組（0.64±0.71）g；與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。（2）前列腺指數：正常組（0.142±0.061），模型組（0.225±0.064），癃閉舒組（0.168±0.092），癃暢顆粒低劑量組（0.199±0.047），癃暢顆粒中劑量組（0.182±0.036），癃暢顆粒高劑量組（0.167±0.039），與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。（3）癃暢顆粒對良性前列腺增生大鼠前列腺上皮細胞fas基因表達影響（平均光密度）：正常組（0.216±0.029），模型組（0.183±0.089），癃閉舒組（0.201±0.129），癃暢顆粒低劑量組（0.200±0.126），癃暢顆粒中劑量組（0.202±0.143），癃暢顆粒高劑量組（0.207±0.177），與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 癃暢顆粒能夠上調大鼠前列腺組織fas表達，縮小模型大鼠前列腺濕質量，減輕病理變化，這可能是該藥臨床有效治療前列腺增生癥的作用機制之一。

癃暢顆粒； 前列腺增生； 細胞凋亡； fas基因

良性前列腺增生（BPH）是老年男性常見疾病，其導致的排尿困難和并發癥嚴重影響患者生活質量，給患者帶來諸多困擾及痛苦。BPH的發病率隨年齡而增長，40～49歲時發生率為1.2%，到60歲時大于50%，80歲時高達83%［1］。BPH手術治療療效明顯，但有一定程度的損傷和并發癥。中藥治療BPH具有悠久的歷史和良好的療效，中藥癃暢顆粒是我院臨床治療前列腺增生癥的經驗方，療效明顯。為了進一步探討癃暢顆粒的作用機制，選擇Wistar大鼠制成BPH模型進行藥物干預，觀察癃暢顆粒對模型大鼠前列腺增生組織凋亡調控基因fas表達的影響，進一步探討癃暢顆粒治療BPH的作用機制，現報告如下。

材料與方法

一、試驗藥物及配制

癃暢顆粒由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院制劑室制劑，主要成分為：炙黃芪、黨參、牛膝、山萸肉、莪術、皂刺、車前子、瞿麥等。癃閉舒膠囊為石家莊科迪藥業有限公司生產，主要成分為：補骨脂、益母草、金錢草、海金沙、琥珀、山慈菇；批準文號為國藥準021203024；丙酸睪酮注射液為上海通用藥業股份有限公司生產，批準文號為：滬衛字（1995）第009001號。

二、實驗動物

Wistar雄性大鼠120只，體質量（350±20）g。由黑龍江中醫藥大學實動物中心提供，合格證號為黑動字第P00102004號。專用鼠飼料由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號為黑動字第P00305007號。

三、主要試劑

大鼠fas兔抗兔抗鼠fas多克隆抗體（武漢博士德生物有限公司提供）。PV-6001二步法試劑盒、DAB顯示劑檢測試劑盒（北京中山生物有限公司提供）。

四、造模與分組

將大鼠普通飼養1周以適應環境，并經觀察無異常后，隨機取20只作正常組，其余100只進行造模。造模方法按文獻［2］并稍做改進。將100只大鼠隨機分為模型組、癃必舒組、癃暢顆粒低劑量組（簡稱癃暢低組）、癃暢顆粒中劑量組（簡稱癃暢中組）、癃暢顆粒高劑量組（簡稱癃暢高組），每組20只。先用戊巴比妥那麻醉后，常規消毒皮膚，經陰囊摘除雙側睪丸，殘端處結扎以確保止血，縫合肌肉、皮膚。術后恢復7d，自術后第8天起，除正常組外所有大鼠均經皮下注射丙酸睪酮5mg/kg，1次/d，連續15d。

五、給藥劑量及方法

從去勢術后第8天起，開始灌胃給藥［3］。癃必舒組劑量為4.42g/（kg?d）（相當于臨床等效劑量的20倍），癃暢顆粒低、中、高3個劑量依次為3.33 g/ （kg?d）（相當于臨床量的10倍）、5.00 g/（kg?d）（相當于臨床量的15倍）、6.67 g（kg?d）（相當于臨床量的20倍），連續給藥，正常組和模型組每日灌胃給等量生理鹽水1次。

六、取材與制樣

各組大鼠分別在給藥后第30天時處死，摘除前列腺各葉。電子天秤稱體質量及前列腺濕質量（以g為單位精確到0.01g），計算前列腺指數（前列腺指數=前列腺濕質量/體質量）。經10%甲醛溶液固定，常規脫水二甲苯透明，浸蠟包埋，以備切片用，HE染色。

七、免疫組化染色

石蠟切片常規脫蠟至水；3%H2O2孵育10min封閉滅活內源性過氧化酶；微波修復抗原：將切片浸入0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，放置在微波爐中加熱5min×2次，間隔10min，冷卻至室溫；0.1mol/LPBS（磷酸鹽緩沖液）洗滌，3min×3次；滴加1∶50兔抗IgG，37℃孵育2h；PBS洗3min×3次；滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP結合體，37℃孵育20min；PBS洗3min×3次；DAB二氨基聯苯- H2O2室溫避光顯色5～10min，自來水充分沖洗；輕度復染，逐級乙醇脫水、透明、中性樹膠封片，Motic-BA400顯微鏡，于40倍視野下攝影，每組每張切片隨機選取5個視野，用Moticimage3.2圖像分析軟件進行分析，計算平均面密度（細胞陽性表達面積與視野總面積百分比）比和光密度（細胞陽性表達強弱）。

八、統計學分析

結 果

一、各組大鼠體質量、前列腺濕質量、前列腺指數的比較

各組大鼠體質量差異無顯著性，各組間具有可比性。模型組前列腺濕質量及指數明顯高于正常組（P ＜0.01），說明造模成功。與模型組比較，癃暢低、中、高組前列腺濕質量及指數明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05和P＜0.01）；與癃閉舒組比較，癃暢中組前列腺濕重及指數均明顯下降，差異有顯著性（P＜0.01和P＜0.05）；癃暢高組前列腺濕質量明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01）；癃暢高組前列腺指數與癃閉舒組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；癃暢低組與癃閉舒組比較，前列腺濕質量、指數，差異無統計學意義（P＞0.05），結果見表1。

二、各組大鼠前列腺組織fas的表達

Motic-BA400顯微鏡，于40×視野下攝影，每組每張切片隨機選取5個視野，用Moticimage3.2圖像分析軟件進行分析，計算平均面密度（細胞陽性表達面積與視野總面積百分比）和光密度（細胞陽性表達強弱）。fas基因陽性表達呈棕黃色，主要表達腺上皮泡質中。正常組陽性表達面積及強度最明顯，模型組表達最低。癃暢顆粒高、中、低劑量組fas的陽性表達均高于模型組。經比較有顯著性差異（P＜0.01和P＜0.05），高劑量組與癃閉舒組比較無顯著性差異（P＞0.05），結果見表2。

三、各組大鼠前列腺組織病理變化

正常組大鼠前列腺腺泡上皮呈單層柱狀或假復層，腺腔內有少量酸性分泌物，腺上皮細胞核圓形，位于基底部，核仁明顯。模型組大鼠整個視野內腺腔充滿，上皮細胞多呈高柱狀或立方狀，常可見細胞肥大扭曲，排列紊亂，細胞間隙增寬，間質中纖維組織增生，以膠原纖維為主。細胞中線粒體腫脹，嵴變少。癃暢高、中組見腺腔明顯減少，管腔細胞多為單層柱狀排列，細胞皺縮，間質少而疏松。癃暢低組與癃必舒組管腔細胞單復層均有出現，上皮細胞多呈高柱狀或立方狀，乳頭狀結構明顯減少。經治療后，各組病理變化較模型組均有不同程度改善，其中以高劑量組改善明顯。

表2 癃暢顆粒對BPH大鼠前列腺上皮細胞fas表達的影響（）

表2 癃暢顆粒對BPH大鼠前列腺上皮細胞fas表達的影響（）

與正常組比較: *P＜0.05， **P＜0.01； 與模型組比較， ▲P＜0.05，▲▲: P＜0.01； 與癃閉舒組比較， #P＜0.05， ##P＜0.01

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表1 癃暢顆粒對BPH大鼠前列腺濕質量及前列腺指數的影響（n=20，）

表1 癃暢顆粒對BPH大鼠前列腺濕質量及前列腺指數的影響（n=20，）

與正常組比較: *P＜0.05， **P＜0.01； 與模型組比較， ▲P＜0.05，▲▲: P＜0.01； 與癃閉舒組比較， #P＜0.05， ##P＜0.01

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討 論

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia BPH）是老年男性常見疾病，隨著我國人民生活水平的提高和平均壽命的延長，BPH的發病率迅速增長［4］，其引起膀胱頸梗阻，出現排尿異常癥狀，最終引起膀胱及腎臟病變，嚴重影響老年人的生活質量。目前在藥物治療BPH的研究中，植物制劑因療效確切，適合長期服用且安全無毒符合本病特點，而日益受到重視。BPH在中醫學中屬“癃閉”范疇。多因年老體弱或久病體虛，勞損腎精，膀胱氣化無力而導致排尿無力。氣化失常，濁陰不降，久病必瘀，痰瘀互結，積而成塊，壓迫尿道而致。《景岳全書?癃閉》所云：“或以敗精，或以槁血，阻塞水道而不通也”。同時還由于濕濁運化不利而淤滯，濕淤日久化熱而出現濕熱下注，故屬本虛標實之證，治宜標本同治，虛實兼顧，“以通為用”，消補并施。以補腎益氣、活血祛瘀、利濕通淋為基本大法，癃暢顆粒就是依據這一基本理論篩選優化而組成的治療BPH的臨床經驗方。方中炙黃芪、黨參、山萸肉補腎益氣，養血行瘀；莪術、牛膝、皂刺活血祛瘀、化積消癥；車前子、瞿麥通閉利小便；川牛膝引血下行，引導諸藥直達病所，諸藥合用，切中病機。臨床研究證實［5］該藥有較好的減輕BPH患者排尿異常癥狀，縮小前列腺體積，改善尿流率參數作用。

眾多研究表明，正常前列腺的大小能保持恒定主要是因為腺體內細胞的增殖與凋亡保持平衡的結果，細胞增殖與凋亡異常是發生BPH的重要原因之一。前列腺增生時由于前列腺組織中各種基因、生長因子等表達水平發生改變，表現為細胞復制增加和（或）細胞死亡數目減少，從而引起總的細胞數目增加，導致前列腺體積增大。BPH的發生細胞死亡的減少可能更為重要［6］。fas廣泛分布于各種組織細胞內，并參與一系列生理過程［7］。fas是一種屬于神經生長因子受體超家族成員的膜受體蛋白，在細胞凋亡過程中起信號傳導作用，誘導表達fas蛋白的細胞發生凋亡［8］。fas能激活至少兩個獨立的通路，并且這兩種通路間存在部分共有信號分子：（1）由fas受體所主導，通過與三聚化的fasL結合而被激活，激活后的fas可以通過下游的接頭蛋白FADD與caspase-8等蛋白形成死亡誘導復合物（death inducing signaling complex，DISC）構成fas信號通路的核心，激活的DISC 復合物通過Caspase-8激活下游的Caspase家族，剪切Caspase-3， 從而引發細胞凋亡［9-11］；（2）在死亡受體fas介導的凋亡途徑中，DISC催化裂解Bcl-2家族成員Bid前體，形成截斷型激活型Bid（trun-cated Bid， tBid），激活的tBid轉位到線粒體，觸發bak和bax同源寡聚作用，啟動細胞色素C的釋放， 啟動細胞凋亡［12］。本實驗結果顯示， BPH組織中fas表達顯著低于正常前列腺組織，癃暢顆粒高、中、低劑量組fas的陽性表達均高于模型組，提示fas表達減少可能是導致前列腺細胞凋亡減少，進而促使BPH形成的原因之一，癃暢顆粒上調fas基因的表達可能是其臨床有效治療前列腺增生的機制之一。

我們的前期研究亦發現［13-16］，癃暢顆粒具有下調前列腺組織bcl-2基因和上調bax基因表達作用，結合本組實驗上調fas基因的表達的結果推測，癃暢顆粒可能具有調控部分前列腺組織細胞增殖與凋亡基因作用，從而實現減輕實驗大鼠的前列腺濕質量、體積，抑制前列腺組織細胞的增生作用。中藥現代藥理研究顯示，癃暢顆粒組方中黃芪、黨參、莪術、牛膝、皂刺等多味中藥，無論是單獨作用還是組方，對包括bax、fas bcl-2等在內的多種凋亡調控基因的表達都有調控作用［17-21］。

綜上所述，癃暢顆粒作為臨床治療前列腺增生癥的有效方劑，其作用機制之一可能是通過調控前列腺組織相關凋亡基因的表達，促進前列腺組織細胞凋亡，從而達到抑制組織增生，縮小前列腺體積，改善臨床癥狀的目的。

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11 Krammer PH.CD95（APO-1/Fas）-mediated apoptosis: live and let die. Adv Immunol 1999； 71: 163-210

12 Kandasamy K， Srinivasula SM， Alnemri ES， et al. Involvement of proapoptotic molecules Bax and Bak in tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL）-induced mitochondrial disruption and apoptosis: differential regulation of cytochrome c and Smac/DIABLO release. Cancer Res 2003； 63（7）: 1712-1721

13 安立文， 張敏道， 趙勇寧. 癃暢顆粒對大鼠前列腺增生組織bcl-2基因表達影響的研究. 中國男科學雜志2009； 23（10）: 31-34

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15 劉洋， 安立文.中醫藥治療良性前列腺增生機理的研究進展與現狀.中國男科學雜志 2006； 20（6）: 71-72

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17 李琦， 溫進坤， 韓梅. 黃芪和當歸對血管平滑肌細胞表型標志基因表達和細胞增殖的影響. 中國動脈硬化雜志 2004； 12（2）: 147-150

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19 李東濤， 孫桂芝， 裴迎霞， 等. 益氣活血軟堅解毒方含藥血清誘導人肝癌細胞系Bel-7402細胞凋亡過程中部分凋亡調控基因變化. 世界華人消化雜志 2006； 14（36）: 3443-3449

20 蘇巧珠， 李海剛.中藥誘導腫瘤細胞凋亡的研究進展. 中藥材 2000； 23（8）: 500-503

21 蔡文清， 黎瑋， 張勇， 等. 中藥對小鼠前列腺細胞增殖及凋亡的影響. 中華泌尿外科雜志 2004； 25（5）: 328-330

（2015-03-24收稿）

The effects of Longchang Granule on the expression of apoptosis gene Fas in prostate tissues of rats with benign prostatehyperplasia*

Yang Shanshan1， An Liwen2**， Liu Wenhong3
1. Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China； 2. Department of Urology， the First Hospital of
Heilongjian University of Chinese Medicine； 3 .HuaianFourth People's Hospital

An Liwen， E-mail:anlw007@aliyun.com

Objective To observe the effects of Longchang particles on apoptosis genes fas in prostatic hyperplasia tissues and explore its mechanism in the treatment of benign prostatic hyperplasia. Methods Total of 120 Wistar male rats were randomly divided into six groups including high-dose Longchang group， the medium-dose Longchang group， the low-dose Longchang group， Longbishu group， the model group and the normal group， and 20 rats in each group. In addition to the normal group， rats in the rest of the group were ovariectomized and then injected with Testosterone Propionate （ TP ）to establish the rat models with benign prostatic hyperplasia. Subsequence， the rats were intragastrically administrated with Longchang particles for 30 days. They were sacri ced and their prostate tissues were collected for wet weight measurement，expression of Fas gene. Results Prostate wet weight of the normal group was （0.62±0.91） g， the model group （0.92±0.50）g， Longbishu group （0.75±0.58） g， Longchang Granule of low -dose group （0.80±0.92） g， Longchang Granule of mediumdose group （0.79±0.10） g， Longchang Granule of high -dose group （0.64±0.71） g； with signi cant differences between the model and the intervention groups（P＜0.05）. Prostate index: the normal group （0.142±0.061）， the model group （0.225±0.064），Longbishu group （0.168±0.092）， Longchang Granule of low -dose group （0.199±0.047）， Longchang Granule of mediumdose group （0.182±0.036）， Longchang Granule of high-dose group （0.167±0.039）， with significant differences between the model and the intervention groups （P＜0.05）. Longchang particles Fas gene expression in epithelial cell proliferation in rat prostate （mean optical density） for benign prostatic: the normal group（0.216±0.029）， the model group（0.183±0.089），Longbishu group （0.201±0.129）， Longchang Granule of low -dose group（0.200±0.126）， Longchang Granule of medium -dose group（0.202±0.143）， Longchang Granule of high -dose group （0.207±0.177）， with signi cant differences between the model and the intervention groups （P＜0.05）. Conclusion Longchang particles can be signi cantly decreased prostate wet weight， ameliorated the pathological changes， upregulated Fas expression which may explain its role in treatment of benign prostatic hyperplasia.

Longchang Granule； prostatic hyperplasia； apoptosis； fas gene

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.08.005

R 697.32

*資金項目資助: 教育部春暉計劃基金資助（基金標號：Z2010043）

**通訊作者， E-mail:anlw007@aliyun.com