聚己內酯/殼聚糖與聚己內酯/聚乳酸支架與人脂肪來源干細胞的生物相容性研究

姚海軍 趙 陽 周 哲 肖冬冬張 明 鄭大超 何創(chuàng)龍 吳稼晟 王 忠*. 上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院泌尿外科（上海 000）；.東華大學化學化工與生物工程學院， 生物材料與組織工程研究室；.上海交通大學材料科學與工程學院金屬基復合材料國家重點實驗室

聚己內酯/殼聚糖與聚己內酯/聚乳酸支架與人脂肪來源干細胞的生物相容性研究

姚海軍1趙 陽1周 哲1肖冬冬1
張 明1鄭大超1何創(chuàng)龍2吳稼晟3王 忠1*
1. 上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院泌尿外科（上海 200011）；
2.東華大學化學化工與生物工程學院， 生物材料與組織工程研究室；
3.上海交通大學材料科學與工程學院金屬基復合材料國家重點實驗室

目的 對比人脂肪來源干細胞（Human adipose derived stem cells，hADSCs）與聚己內酯/聚乳酸（Polycaprolactone/Polylactide， PCL/PLA）和聚己內酯/殼聚糖（Polycaprolactone/chitosan，PCL/CS）復合支架的生物相容性，為進一步體內組織修復提供依據。方法 體外分離、培養(yǎng)和擴增hADSCs，分別制備PCL/PLA、PCL/CS復合支架，掃描電鏡觀察支架材料的表面情況。取材料浸提液培養(yǎng)hADSCs，CCK-8法檢測細胞活力，評價支架的細胞毒性。hADSCs傳代擴增后，接種到支架材料上，裸鼠皮下培養(yǎng)2周，HE染色觀察細胞在支架上的生長情況。結果 hADSCs與成纖維細胞相似，呈“梭形”，并以集落形式生長。掃描電鏡觀察PCL/CS孔徑在100μm左右，孔隙率為88.76%，而PCL/PLA支架孔徑則在40μm左右，孔隙率為91.45%。hADSCs在PCL/CS浸提液中培養(yǎng)1、3、7天的相對增殖率分別為98.6%、101.6%、110.3%，而PCL/PLA組為98.1%、100.7%、108.4%，說明hADSCs在兩種浸提液中均保持較高的增殖率，即兩種合成支架均無細胞毒性。hADSCs復合兩種支架體內培養(yǎng)后，HE染色后可見有大量細胞長入PCL/CS支架內部，同時免疫組化HLA-Ⅰ檢測發(fā)現，支架材料內部分細胞陽性表達，說明PCL/CS支架內該部分的細胞來源于人，即hADSCs。而在PCL/PLA內部滲透進入的細胞不如PCL/CS支架組。結論 PCL/ CS和PCL/PLA支架安全無毒，hADSCs在PCL/CS支架上顯示更好的細胞相容性，該支架可以作為hADSCs的載體材料，用于組織工程膀胱修復的研究。

干細胞； 組織支架； 組織工程； 生物相容性材料

長期以來，大面積或嚴重缺損的膀胱修復一直是泌尿外科醫(yī)生臨床中所面臨的難題和挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)方法需借助其他組織器官來完成修補、替代，但無法做到良好的組織再生修復。雖然組織工程已為修復大面積缺損的組織器官開辟了一條嶄新的途徑［1］，但其中仍有許多懸而未決的問題，這當中可能最為關鍵的依舊是種子細胞、支架材料的選擇和兩者相互作用后達到組織再生。

目前認為，脂肪來源干細胞（human adipose derived stem cells，hADSCs）具有跨胚層的多向分化能力，經適當條件調控后可向膀胱平滑肌和尿路上皮細胞進行誘導分化。同時由于其取材方便，自我更新快，體外培養(yǎng)、增殖能力旺盛，是作為組織工程化膀胱的“熱門”種子細胞。

人工合成材料具有良好的力學特性，生物性能均一，能大規(guī)模生產等優(yōu)勢，逐漸成為支架材料研究熱點，特別是經特殊修飾后的復合人工材料，可充分發(fā)揮各種材料成分的優(yōu)點，達到揚長避短、優(yōu)勢互補，在膀胱組織工程修復研究中展現出獨特的優(yōu)勢［2-5］。

本實驗先對選取聚己內脂/殼聚糖（polycaprolactone/ chitosan， PCL/CS）、聚己內酯/聚乳酸（Polycaprolactone/ Polylactide， PCL/PLA）材料進行必要的性能分析，然后將hADSCs在PCL/CS、PCL/PLA浸提液中培養(yǎng)，檢測兩種復合支架的細胞毒性。再將hADSCs與這兩種復合支架進行體內復合培養(yǎng)，檢測其在支架上的生長情況，從而探討哪一種復合支架更適合作為hADSCs的支架材料用于組織工程膀胱缺損的修復。

材料與方法

一、材料

本實驗研究得到上海交通大學醫(yī)學院倫理委員會批準。hADSCs 取自我院整復外科門診進行抽脂手術后廢棄的健康成年女性人體的脂肪組織，并獲患者知情同意。分別由東華大學化學化工與生物工程學院制作并篩選出合適的PCL/PLA復合支架，由上海交通大學材料科學與工程學院制作并篩選出合適的PCL/ CS復合支架。其中，合成復合支架材料的PLA（寧波環(huán)球塑料制品有限公司），PCL（上海天清材料有限公司），CS購自國藥集團化學試劑有限公司。DMEM培養(yǎng)基采用市售產品。

二、方法

（一）hADSCs的分離培養(yǎng)

參照Zuk方法［6］進行分離培養(yǎng)，并得到課題組多次證實后使用。

（二）PCL/CS、PCL/PLA支架的制備及掃描電鏡觀察［2，7］

兩種材料分別在上海交通大學材料科學與工程學院和東華大學化學化工與生物工程學院制備。PCL/CS復合支架利用冷凍干燥技術以及真空熱交聯(lián)方法進行制備， CS與PCL按照質量百分比2:8混合。PCL/PLA復合支架利用熱致相分離技術得到，PLA與PCL按照質量以3:1混合。最后將材料制備成大小10mm×10mm，厚度為2mm的補片，酒精消毒備用。

制備所得的PCL/CS、PCL/PLA支架按照掃描電鏡要求分別進行噴金鍍膜、液氮淬斷和噴金處理后放入掃描電子顯微鏡觀察，觀察樣品孔洞的大小、具體形貌以及疏密程度。

（三）支架材料孔隙率測量

將制備得到的支架樣品烘干，分析天平精確稱得多空支架的干燥質量，測量長度、寬度以及高度并計算得到支架表觀體積，通過相應公式計算得出共混物塊體的密度ρ，由下述公式得到孔洞體積分數，即

（四）hADSCs在支架浸提液中增殖率測定

將復合支架材料置于75%的酒精中，浸泡消毒過夜，吸棄酒精，紫外燈照1h，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%的CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中進行24h培養(yǎng)，收集浸提液。分別設對照組（正常DMEM培養(yǎng)基）和實驗組（支架浸提液）。選取傳代后生長良好的第三代hADSCs，接種于96孔板中培養(yǎng)。24h后吸出培養(yǎng)基，實驗組與對照組分別添加相對應的支架浸提液和培養(yǎng)基100μL并繼續(xù)培養(yǎng)。分別于第1、3、7天對hADSCs增殖率進行測定，在相應時間點，實驗組與對照組各取5個孔，每孔加入10μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1h，在酶標儀上選用450nm波長測定各孔A值，并計算相對增殖率=實驗組A值/對照組A值×100%。對照美國藥典中細胞相對增殖率與細胞毒性分級的關系，評價毒性情況。

（五）hADSCs與支架共培養(yǎng)

所謂共培養(yǎng)［8］就是將細胞與支架混合共同培養(yǎng)，使得細胞能完全適應支架環(huán)境并穩(wěn)定地貼附在支架表面。將支架裁成10 mm×10 mm大小，75%酒精浸泡消毒過夜，吸棄酒精，紫外燈照1h，PBS沖洗后加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基預培養(yǎng)過夜。第2天取過夜培養(yǎng)的支架材料，然后吸棄上清及材料表面的培養(yǎng)基后待用。選取傳代后生長良好的第三代hADSCs制成密度為2×106/mL的細胞懸液，取1mL細胞懸液使細胞均勻接種至每個預培養(yǎng)過的支架材料表面，待細胞擴散和黏附于支架后再次小心加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、體積分數為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進行體外培養(yǎng)。體外培養(yǎng)3h后，植入裸鼠皮下進入體內培養(yǎng)。

（六）細胞增殖的組織化學觀察及HLA-I檢測

裸鼠皮下培養(yǎng)后2周后取材，取材后進行石蠟切片：立即用4%的多聚甲醛溶液固定，酒精梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片機將材料切成 6μm厚，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察細胞在支架內的生長情況。HLA-I檢測：以3%過氧化氫溶液去除內源性過氧化物酶，再用0.1%胰酶修復抗原，然后滴加羊血清封閉非特異性抗原。一抗為兔抗人HLA-Ⅰ抗體（anti- HLA-Ⅰ，Epitomics，USA），4℃過夜。二抗為偶聯(lián)過氧化物酶的羊抗兔單克隆抗體，DAB顯色。蘇木素襯染細胞核，1%鹽酸酒精分化，95%～100%乙醇脫水，二甲苯透明處理，中性樹膠封片，光鏡觀察。

（七）統(tǒng)計學分析

結 果

一、hADSCs的形態(tài)、生長特性

原代細胞經膠原酶消化后培養(yǎng)4～6h，可見有部分細胞貼壁。這些貼壁細胞呈梭形，類似于成纖維細胞樣形態(tài)，并有少量三角形、多邊形細胞混于其中。隨著培養(yǎng)時間的延長，這部分貼壁細胞數量逐步增多，并出現集落狀生長，集落中細胞形態(tài)為典型梭形，但集落大小參差不齊，所包含的細胞數從數個至數百個不等。24h后進行首次換液，培養(yǎng)時每48h換液，培養(yǎng)1周左右可達80%～90%的致密層，繼續(xù)培養(yǎng)至9～10d可形成100%融合的致密單層。傳代后的ADSCs細胞形態(tài)一致，主要為梭形，其中少量為三角形或多邊形，且生長旺盛，15代以內細胞形態(tài)無明顯變化。

二、支架材料的構建

制備PCL/CS以及PCL/PLA多孔支架，其外觀均呈白色，掃描電鏡觀察PCL/CS支架孔徑在100μm左右，孔隙率在88.76%，而PCL/PLA支架孔徑則在40μm左右，但大小不一，其孔隙率為91.45%。上述支架均具有較高的孔隙率能為細胞的增殖提供足夠的空間，接近理論計算值（約90%），符合度良好。孔隙率的增加，可擴大細胞接觸面，使得更多的細胞吸附于支架上。理想的孔隙率更利于種子細胞滲入支架內部并進行增殖，提高細胞接種的密度，見表1。

表1 PCL/CS多孔支架的孔徑及孔隙率

三、hADSCs在PCL/CS及PCL/PLA浸提液中增殖率的測定

各實驗組和對照組的細胞A值均隨培養(yǎng)時間延長而增大，第1、3、7天PCL/CS組的細胞相對增殖率分別為98.6%、101.6%、110.3%；而PCL/PLA組分別為98.1%、100.7%、108.4%（表2）。統(tǒng)計結果顯示，第1，3，7天各實驗組與對照組之間的A值無顯著性差異（P＞0.05），說明浸提液對細胞增殖無明顯影響，符合組織工程材料的基本要求。對照美國藥典中細胞毒性分級，兩組材料浸提液的毒性評級均為0或1級（見表2），可以說明細胞在浸提液中保持較高的增殖率，即無細胞毒性。

表2 不同支架材料浸提液的細胞相對增殖度與毒性等級評價

細胞在各支架材料浸提液中的細胞生長曲線見圖1。各實驗組細胞的生長趨勢均與對照組類似，1～3d細胞呈生長迅猛，而3～7d細胞生長有所放緩，但仍顯示出細胞生長狀態(tài)良好。從細胞生長曲線分析，PCL/CS、PCL/PLA組細胞生長均未受抑制。

四、細胞和支架材料的復合情況

hADSCs復合兩種支架，經過2周體內培養(yǎng)后，細胞均能長入支架的空隙內， PCL/PLA組細胞主要附著的支架表面，少量細胞滲透到支架內部空隙中，但大量細胞長入 PCL/CS支架內部（圖2B）［2］，說明相對于PCL/PLA，PCL/CS支架具有更好的生物相容性。免疫組化HLA-Ⅰ檢測發(fā)現，支架材料內部分細胞陽性表達，說明支架內該部分的細胞來源于人，即hADSCs（圖2C）。

圖1 MTT法比較脂肪來源干細胞在不同支架上的生長曲線

圖2 hADSCs復合PCL/PLA、PCL/CS支架體內培養(yǎng)的組織學檢測（HE染色， ×200）A: hADSCs復合PCL/PLA體內培養(yǎng)2周； B: hADSCs復合PCL/CS體內培養(yǎng)2周； C: hADSCs復合PCL/CS支架體內培養(yǎng)HLA-Ⅰ免疫組化檢測（×200）

討 論

理想的組織工程支架不僅為種子細胞提供三維立體空間支撐，更重要的是引導種子細胞按特定形態(tài)促進組織構建和再生，同時作為細胞間信號轉導和相互作用的媒介，提供細胞生長所必需的生物活性劑，促進移植物血管化，最后被機體降解和新生軟組織替代［9］，支架材料的降解不會對種子細胞生存的微環(huán)境產生不良影響。

組織工程支架材料主要分為天然細胞外基質、脫細胞基質及人工合成可降解聚合材料。研究表明CS殼聚糖（chitosan，CS）又稱脫乙酰甲殼素，可由自然界廣泛存在的幾丁質經過脫乙酰作用而得到的，是一種優(yōu)良的天然生物材料，其結構與糖胺聚糖類似的。它是迄今為止自然界中所發(fā)現的唯一具有帶有正電荷、明顯堿性的天然多糖［10］。另外，殼聚糖成膜性好，與生俱有高效的生物可降解性和生物相容性，還擁有可利用的活性基團，使其在組織工程中得到廣泛的應用［4，5］。PCL雖然具有良好的力學性能，但是其高度疏水性以及缺乏生物活性等不足，限制了其在組織工程中的進一步應用。另外，在研究中我們也發(fā)現hADSCs與支架經共培養(yǎng)后轉入體內，細胞均可有效滲入支架內，說明PCL經過CS或PLA修飾后，其材料的性能出現優(yōu)勢互補，從而更加有利于種子細胞在支架材料上進行貼附生長并增殖。同時還發(fā)現，相對于PCL/PLA，更多的細胞長入PCL/CS支架的空隙內，說明此支架具有更好的細胞親和性。經免疫組化HLA-Ⅰ檢測后發(fā)現，體內培養(yǎng)2周后，大量hADSCs能有效滲透進入PCL/CS支架內部，表明PCL/CS多孔支架更適于hADSCs黏附擴增。這可能是由于CS與PCL復合后，CS的良好生物活性改善了PCL的疏水性，使其具有更佳的生物相容性。而PLA同樣為生物聚合材料，對PCL的疏水性改善不明顯，有可能導致其生物活性有所欠缺。也有可能是CS的多糖特性促進細胞的生長和增殖［10］，而PLA降解后的產物乳酸造成的酸性環(huán)境影響細胞存活［11］。

本實驗結果提示，兩種支架均安全無毒，適合進行細胞材料的接種；相對于PCL/PLA，PCL/CS具有更好的細胞相容性，可進一步用于體內組織工程膀胱缺損修復的實驗研究。利用PCL/CS并植入合適的種子細胞進行大面積膀胱缺損修復，是下一步研究的方向，并可進一步評估膀胱替代后的功能情況。

1 Chung SY. Bladder tissue-engineering: a new practical solution？. Lancet 2006； 367（9518）: 1215-1216

2 周哲， 吳稼晟， 張明， 等. 人脂肪來源干細胞與聚己內酯/殼聚糖支架的生物相容性研究. 組織工程與重建外科2013； 9（3）: 133-136

3 Sarasam A， Madihally SV. Characterization of chitosanpolycaprolactone blends for tissue engineering applications. Biomaterials 2005； 26（27）: 5500-5508

4 Feng H， Dong CM. Preparation and characterization of chitosan-graft poly（e-caprolactone） with an organic catalyst. J Polym Sci A Polym Chem 2006； 44（18）: 5353-5361

5 Chen H， Fan X， Xia J， et al. Electrospun chitosan-graftpoly （e-caprolactone）/poly （e-caprolactone） nanofibrous scaffolds for retinal tissue engineering. Int J Nanomedicine 2011； 6: 453-461

6 Zuk PA， Zhu M， Ashjian P， et a1. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell 2002；13（12）: 4279-4295

7 姚海軍， 趙陽， 周哲， 等. 人脂肪來源干細胞與左旋聚乳酸/聚己內酯支架的體內外生物相容性研究. 組織工程與重建外科 2014； 10（5）: 255-258

8 張明， 周哲， 周娟， 等. 人脂肪干細胞與豬尿路上皮細胞隔離共培養(yǎng)后向尿路上皮樣細胞分化. 中華臨床醫(yī)師雜志?電子版 2012； 6（8）: 109-112

9 Brehmer B， Rohrmann D， Becker C， et al. Different types of scaffolds for reconstruction of the urinary tract by tissue engineering. Urol Int 2007； 78（1）: 23-29

10 Bhattarai N， Edmondson D， Veiseh O， et al. Electrospun chitosan-based nano bers and their cellular compatibility. Biomaterials 2005； 26（31）: 6176-6184

11 趙宇， 胡平， 陸應麟， 等. 新型生物可降解材料與骨髓間充質干細胞生物相容性研究. 中國修復重建外科雜志2004； 18（2）: 104-107

（2015-04-20收稿）

Biocompatibilty analysis of human adipose-derived stem cells and Polycaprolactone/chitosan or Polycaprolactone/ Polylactide scaffold

Yao Haijun1， Zhao Yang1， Zhou Zhe1， Xiao Dongdong1， Zhang Ming1， Zheng Dachao1， He Chuanglong2， Wu
Jiachen3， Wang Zhong1*
1. Department of Urology，Shanghai 9th People' s Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine ， Shanghai 200011， China； 2. College of Chemistry， Chemical Engineering and Biotechnology， Donghua University； 3. State Key Lab
of Metal Matrix Composites， Shanghai Jiaotong University School of Materials Science and Engineering

Wang Zhong， zhongwang2010@sina.com

Objective To observe the growth of human adipose derived stem cells cultured on Polycaprolactone/ chitosan （PCL/CS） and Polycaprolactone /Polylactide（PCL/PLA） biomaterials in vitro and in vivo. Methods hADSCs were isolated from human subcutaneous adipose tissue after collagenase digesting， ltrating and centrifuging. The scaffoldwas prepared by freeze-drying technique and the method of vacuum thermal cross-linking. The cytotoxicity of scaffold was evaluated by cell growth. The third passage of hADSCs were seeded onto the PCL/CS and PCL/PLA scaffolds and were subcutaneously planted into nude mice for observing hADSCs growth in vivo. Results hADSCs growed faster in the leaching solution of the PCL/CS or PCL/PLA.The PCL/CS，indicating that PCL/PLA scaffolds were non-toxic for hADSCs growth.The histological analysis showed that hADSCs could grow in the space of the scaffolds no matter in vitro or in vivo culture.When cultured in vitro， some cells adhered at the edge of the scaffolds 1 week later and more cells grew into the inside of the scaffolds after 2 weeks. When cultured in vivo， a great deal of cells grew into the scaffolds. Conclusion Both of PCL/CS and PCL/PLA scaffolds are non-toxic， but former has a better biocompatibility with hADSCs than later，suggesting that it can be used as a vehicle for hADSCs in tissue engineering repair of bladder defect reconstruction.

stem cells； tissue scaffolds； tissue engineering； biocompatible materials

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.08.004

R 318.08

*通訊作者， E-mail: zhongwang2010@sina.com