前泌通片基于Th1/Th2細胞平衡對大鼠慢性非細菌性前列腺炎的作用機理研究*

李廣森 常德貴， 張培海 尤耀東 鐘振東俞旭君 陳帝昂 安志濤 梅雪峰 蔡 劍** 畢明帥**.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院男科（成都 6007）； . 成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院男科；.四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院； . 成都中醫(yī)藥大學(xué)； . 四川省人民醫(yī)院病理科

前泌通片基于Th1/Th2細胞平衡對大鼠慢性非細菌性前列腺炎的作用機理研究*

李廣森1常德貴1，2張培海3尤耀東4鐘振東5
俞旭君2陳帝昂1安志濤4梅雪峰1蔡 劍1**畢明帥1**
1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院男科（成都 610072）； 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院男科；
3.四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院； 4. 成都中醫(yī)藥大學(xué)； 5. 四川省人民醫(yī)院病理科

目的 探究基于Th1/Th2細胞平衡前泌通片對大鼠慢性非細菌性前列腺炎的治療作用機理。方法 60只SD雄性大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性對照組、前泌通片低中高劑量組，每組10只。除空白組，余各組建立慢性非細菌性前列腺炎模型。建模成功后，陽性對照組給予前列通瘀膠囊混懸液灌胃，前泌通片低中高劑量組分別給予不同劑量前泌通混懸液灌胃，空白組給予生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃4周，末次給藥后24h，股動脈放血處死大鼠，光鏡下觀察前列腺組織病理改變，免疫組化法檢測IFN-γ和IL-4并計算IFN-γ/IL-4比值。結(jié)果 與模型組比，前泌通片高中劑量組組織炎癥明顯減輕，前泌通片高劑量組IFN-γ和IL-4含量顯著降低（P＜0.01），前泌通片中低劑量組IL-4含量顯著降低（P＜0.01），前泌通片高中低劑量組IFN-γ/IL-4比值顯著升高（P＜0.01）。結(jié)論 前泌通片可減輕慢性非細菌性前列腺炎大鼠組織炎癥和下調(diào)IFN-γ、IL-4含量，上調(diào)IFN-γ/IL-4比值。

前泌通片； 前列腺炎； Th1細胞； Th2細胞

慢性前列腺炎（ChronicProstatitis，CP）是男性常見疾病，發(fā)病率在6.0%～ 32.9%之間［1］，其中慢性非細菌性前列腺炎（Chronic abacterial prostatitis，CAP）約占前列腺炎綜合征的90%～95%，其病因和發(fā)病機制尚不明確［2］，故西醫(yī)治療效果不明顯。近年來的研究表明，中醫(yī)藥在該病的治療中發(fā)揮著越來越重要的作用［3，4］。有研究顯示，自身免疫和T細胞增殖反應(yīng)可能參與了CAP的發(fā)病過程，較多地關(guān)注免疫因素與前列腺炎的關(guān)系［5］。CAP中醫(yī)學(xué)多從濕熱、瘀阻、腎虛論治，關(guān)于CAP證型調(diào)查顯示，氣滯血瘀證、肝氣郁結(jié)證和濕熱下注證的出現(xiàn)頻率較多［6］，且多合并出現(xiàn)，故治療上多以理氣活血、清熱利濕通淋為主。前泌通片（原名增瀑顆粒）正是在上述治則的指導(dǎo)下，經(jīng)我科多年臨床經(jīng)驗總結(jié)，由天臺烏藥散加減化裁而來。經(jīng)臨床觀察顯示，前泌通片治療CAP療效滿意，對疼痛癥狀的改善尤為突出［7］。本實驗通過研究前泌通片對炎性因子IFN-γ和IL-4的調(diào)控進一步影響Thl/Th2細胞的平衡以及病理變化來探討前泌通片對治療CAP的免疫機制。

材料與方法

一、材料

（一）實驗藥物

前列通瘀膠囊生產(chǎn)單位：珠海星光制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字219990060。

前泌通片生產(chǎn)單位：成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，川藥制字：Z20070658。

（二）實驗動物

選取10～12月齡健康雄性、清潔級SD大鼠60只，體重300～400g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心（川實動管127號）提供，常規(guī)馴養(yǎng)1周。

（三）儀器及試劑

日本OLYMPUS生物顯微鏡、-80℃低溫冰箱、低溫離心機、恒溫水浴鍋、MicromHM 340E 石蠟切片機等。IFN-γ免疫組化一抗、IL-4免疫組化一抗，由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。

二、方法

（一）實驗分組

將60只雄性SD大鼠，正常喂養(yǎng)1周，隨機分為6組：空白對照組（空白組）、CAP模型組（模型組）、CAP+前列通瘀膠囊組（陽性對照組）、CAP+前泌通片低劑量治療組（低劑量組）、CAP+前泌通片中劑量治療組（中劑量組）、CAP+前泌通片高劑量治療組（高劑量組），每組各l0只。

（二）實驗造模

依據(jù)魏武然［8］建立的CAP大鼠動物模型造模。具體方法是：模型組、對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠均用25%烏拉坦按1g/Kg量，經(jīng)腹腔注射麻醉，無菌條件下做去勢手術(shù)，術(shù)后放回鼠籠，密切觀察。于術(shù)后第2天皮下注射苯甲酸雌二醇0.25mg/kg，qd，連續(xù)30d。空白組不做任何處理，正常喂養(yǎng)。

（三）給藥方法

在最后一次皮下注射苯甲酸雌二醇后第2天，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予1.9g/kg?d-1、3.8g/kg?d-1、7.6g/kg?d-1（分別相當(dāng)于推薦臨床試驗70kg成人日用劑量的5倍、l0倍、20倍）前泌通片灌胃；對照組給予前列通瘀膠囊3.9g/kg?d-1（相當(dāng)于臨床試驗70kg成人日用劑量的20倍）灌胃；空白組給予灌服0.9%的生理鹽水。采用等容積不等濃度藥液法給藥，0.1ml/10g體重連續(xù)用藥4周。

（四）標(biāo)本采集

末次給藥后24h，股動脈放血處死大鼠，剖取大鼠前列腺左葉迅速放置于10%福爾馬林液固定，24h后作冠狀面取材，石蠟包埋，以備切片用。另取部分組織與-80℃保存待測。

（五）組織病理學(xué)檢查

取部分前列腺組織經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋切片，常規(guī)S-P染色，光鏡下觀察大鼠前列腺腺腔及間質(zhì)的炎性細胞浸潤情況。陽性表現(xiàn)：炎癥細胞內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒。

（六）檢測指標(biāo)及方法

前列腺組織IFN-γ和IL-4蛋白表達：采用免疫組織化學(xué)法對前列腺組織IFN-γ和IL-4蛋白表達進行檢查并計算IFN-γ/IL-4比值。

（七）統(tǒng)計方法

結(jié) 果

一、病理學(xué)檢查結(jié)果

鏡下觀察結(jié)果空白組大鼠前列腺組織標(biāo)本前列腺組織腺腔結(jié)構(gòu)完整，腺泡上皮為單層柱狀或立方上皮，腺腔內(nèi)散在分布有棕黃色的炎性分泌物，間質(zhì)內(nèi)偶見少量淡黃色的炎性細胞浸潤（見華君圖1A）。模型組大鼠前列腺組織標(biāo)本前列腺組織腺腔結(jié)構(gòu)萎縮、消失，基底膜被破壞，腺上皮變?yōu)楸馄綘睿g質(zhì)和腺上皮內(nèi)含有大量的棕黃色炎癥細胞及炎性分泌物，切片內(nèi)導(dǎo)管損毀嚴重（見圖1B）；前列通瘀組大鼠前列腺組織標(biāo)本前列腺組織腺腔結(jié)構(gòu)基本完整，腺上皮為單層柱狀，間質(zhì)內(nèi)和腺腔內(nèi)含有少量的棕黃色炎癥細胞及炎性分泌物（見圖1C）；前泌通片高劑量組大鼠前列腺組織標(biāo)本前列腺組織腺腔結(jié)構(gòu)基本完整，腺上皮為柱狀上皮，腺腔變大，間質(zhì)和腺腔內(nèi)含有少量的棕黃色炎癥細胞及炎性分泌物（見圖1D）；前泌通片中劑量組大鼠前列腺組織標(biāo)本前列腺組織腺腔結(jié)構(gòu)基本完整，腺上皮為柱狀上皮，腺腔變大，間質(zhì)和腺腔內(nèi)含有少量的棕黃色炎癥細胞及炎性分泌物（見圖1E）；前泌通片低劑量組大鼠前列腺組織標(biāo)本前列腺組織腺腔結(jié)構(gòu)部分萎縮，破壞，腺上皮為扁平上皮，腺腔結(jié)構(gòu)不明顯，間質(zhì)和部分完整的腺腔內(nèi)含有大量的棕黃色炎性細胞及炎性分泌物（見圖1F）。

圖1 光鏡下各組大鼠前列腺組織圖 （IHC×200）A: 空白組； B: 模型組； C: 陽性對照組； D: 前泌通片高劑量組； E: 前泌通片中劑量組； F: 前泌通片低劑量組

二、前泌通片對大鼠前列腺組織IFN-γ/IL-4比值的影響

各實驗組大鼠前列腺組織IFN-γ/IL-4比值結(jié)果見表1。

由表1可知，與空白組比較，模型組大鼠前列腺組織IFN-γ含量、IL-4含量顯著升高（P＜0.01），F(xiàn)N-γ/IL-4比值顯著降低（P＜0.01）。提示造模成功。

與模型組比較，前泌通片高劑量組大鼠前列腺組織IFN-γ含量、IL-4含量顯著降低（P＜0.01），前泌通片中劑量組、前泌通片低劑量組大鼠前列腺組織IL-4含量顯著降低（P＜0.01），前泌通片中劑量組、前泌通片低劑量組大鼠前列腺組織IFN-γ含量降低不明顯（P＞0.05），前泌通片高劑量組、前泌通片中劑量組、前泌通片低劑量組大鼠前列腺組織IFN-γ/ IL-4比值顯著升高（P＜0.01）。提示前泌通片高劑量組所使用的藥物能夠下調(diào)大鼠前列腺組織IFN-γ和IL-4含量并且能夠上調(diào)IFN-γ/IL-4比值，而前泌通片中劑量組、前泌通片低劑量組所使用的藥物濃度能夠下調(diào)大鼠前列腺組織IL-4含量，也能上調(diào)IFN-γ/IL-4比值。

表1 各實驗組大鼠前列腺組織IFN-γ/IL-4比值（）

表1 各實驗組大鼠前列腺組織IFN-γ/IL-4比值（）

與空白組對比， *P＜0.01； 與模型組對比， △P＜0.01

組別 大鼠（只） IFN-γ（ng） /IL-4（ng） IFN-γ/IL-4比值空白組 9 669.4711±11.34061 699.5944±20.49162 0.96278±0.29202模型組 6 932.0117±37.39329* 1254.5700±75.85511* 0.74800±0.19701*陽性對照組 6 751.4450±26.27758△ 734.3833±29.20593△ 1.03133±0.53838△前泌通片高劑量組 6 692.5067±51.09733△ 633.7667±55.86556△ 1.10017.±0.23949△前泌通片中劑量組 6 892.7983±31.75990 816.4233±8.36383△ 1.09217±0.27035△前泌通片低劑量組 6 879.8600±36.45963 990.4483±93.43999△ 0.91333±0.57821△

與模型組對比，前列通瘀組大鼠前列腺組織IFN-γ含量、IL-4含量顯著降低（P＜0.01），IFN-γ/IL-4比值顯著升高（P＜0.01）。提示前列通瘀組所使用的藥物濃度能夠下調(diào)大鼠前列腺組織IFN-γ含量、IL-4含量，也能上調(diào)IFN-γ/IL-4比值。

討 論

CP是男性常見和多發(fā)的疾病，發(fā)病率高，病程遷延，難愈，嚴重影響患者生活質(zhì)量。在CP中，CAP更為多見［9］。關(guān)于CAP的病因和發(fā)病機制，尚未完全明確，可能與免疫反應(yīng)、微生物因素、尿液返流、精神心理因素、遺傳因素、自主神經(jīng)功能紊亂、前列腺的慢性充血等有關(guān)［10］，其基本的病理發(fā)展過程是腺體周圍血管充血和炎性細胞滲出，形成腺體周圍炎性細胞套，腺上皮中炎性細胞浸潤并破壞腺上皮，腺腔內(nèi)炎性滲出物形成［11］。

自1986年Mosmann等［12］發(fā)現(xiàn)CD4 T細胞按其分泌的細胞因子可分為Th1和Th2型以來，人們對Th1/Th2細胞失衡與眾多免疫性疾病的關(guān)系研究日益深入。Thl細胞主要合成IL-2、IFN-γ等，其中IFN-γ為其特征性細胞，主要參與機體的細胞免疫。Th2細胞主要合成IL-4，IL-5等，其中以IL-4為其特征性細胞，主要參與機體的體液免疫。因此作為Thl的特征性細胞因子IFN-γ和作為Th2的特征性細胞因子IL-4之間的比值可分別反映Thl與Th2的細胞免疫應(yīng)答水平。Thl型與Th2型免疫應(yīng)答之間存在著相互牽制的調(diào)節(jié)機制，能夠使得機體維持動態(tài)免疫平衡。Thl細胞產(chǎn)生的IFN-γ可抑制Th2類細胞因子的產(chǎn)生，Th2類細胞產(chǎn)生的IL-4和IL-10則可下調(diào)Thl細胞的功能，兩者相互作用，相互影響，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮中心調(diào)節(jié)作用。在生理條件下，機體Thl/Th2細胞的免疫功能處于動態(tài)平衡狀態(tài)，一旦這種平衡發(fā)生偏離，機體就會趨向疾病狀態(tài)。近年來越來越多的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)自身免疫和T細胞增殖反應(yīng)可能參與了CAP的發(fā)病過程［13］，CAP可能與自身免疫導(dǎo)致的生殖系統(tǒng)（包括前列腺）損傷有關(guān)，而泌尿道感染、急性細菌性前列腺炎和創(chuàng)傷等是其加劇因素。已有的研究表明，免疫反應(yīng)參與了CP的發(fā)病機制［14］。

本病歸屬于中醫(yī)“淋癥”、“精濁”、“白淫”等疾病范疇中，CP的病因復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多變，病因多屬于氣滯、瘀血、濕熱、氣虛或腎虛，實者為氣滯、瘀阻、濕熱；虛者以腎虛為主。臨床醫(yī)家多責(zé)之于濕熱瘀濁［15］，在CP發(fā)病過程中，我們認為，氣滯、血瘀、濕熱、腎虛為其主要病機，而氣滯血瘀是最主要的病機，氣滯血瘀貫穿于疾病的全過程。故主張治療應(yīng)以疏肝行氣、活血止痛為主，同時配合清熱利濕的中藥。前泌通片（原名增瀑顆粒）正是在上述治則的指導(dǎo)下，經(jīng)我科多年臨床經(jīng)驗總結(jié)，由天臺烏藥散加減化裁而來，方中臺烏藥、延胡索行氣止痛、活血化瘀為治療CAP的主藥，臺烏藥辛溫，功專行氣，治胸腹諸痛和尿頻遺尿；延胡索辛苦溫，活血行氣止痛，善治氣血瘀滯諸痛。二藥配伍，互相促進，活血行氣止痛效彰。木香乃三焦氣分之藥，能升降諸氣，青皮疏肝理氣、消積化滯，檳榔行氣利水，三藥配合，使行氣止痛功效增強。澤蘭活血祛瘀、利水消腫，配伍延胡索可改善CP的不適癥狀；CAP多伴有尿頻尿急等濕熱下注的癥狀，黃柏作為清熱燥濕藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒作用；川牛膝活血通經(jīng)、補肝腎、強筋骨、利水通淋、引火下行，善引諸藥下行，以使藥達病所，治五淋尿血，莖中痛。以上諸藥合用，具有疏肝行氣、活血止痛、清熱利濕的作用。

本研究結(jié)果顯示，CAP大鼠模型組IFN-γ含量、IL-4含量顯著升高，IFN-γ/IL-4比值降低，Thl/Th2極化異常，提示免疫因素參與了CAP的發(fā)病過程。而前泌通片高劑量組大鼠前列腺組織IFN-γ和IL-4含量降低，IFN-γ/IL-4比值升高；前泌通片中低劑量組大鼠前列腺組織IL-4含量降低，IFN-γ/IL-4比值升高。提示前泌通片在治療CAP的機制中，可能是通過調(diào)節(jié)IFN-γ和IL-4含量以及調(diào)節(jié)IFN-γ/IL-4比值來改變調(diào)控Thl/Th2比值變化來達到治療目的的。本實驗病理結(jié)果顯示，前泌通片高、中劑量組與模型組相比較，存活的大鼠前列腺組織病理損傷明顯減輕：大鼠前列腺腺腔結(jié)構(gòu)都基本完整，腺上皮為柱狀上皮，腺腔變大，間質(zhì)和腺腔內(nèi)的棕黃色炎癥細胞及炎性分泌物較模型組減少。由此可推斷，前泌通片在治療CAP的過程中也可能通過減輕前列腺炎組織的病理變化來達到治療目的。

1 米華， 陳凱， 莫曾南. 中國慢性前列腺炎的流行病學(xué)特征. 中華男科學(xué)雜志 2012； 18（7）: 579-582

2 唐孝達. 慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征診治中值得商榷的問題. 中華男科學(xué)雜志 2003； 9（6）: 403-406

3 張朝德， 陳剛. 慢性前列腺炎/慢性骨盆疼痛綜合征的中西醫(yī)藥物治療進展. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志 2011； 20（12）: 1539-1541

4 李大偉， 戴寧. 中醫(yī)藥治療慢性非細菌性前列腺炎的進展. 中醫(yī)藥臨床雜志 2010； 22（1）: 85-87

5 韋超， 劉朝東， 王洪志， 等. 慢性非細菌性前列腺炎的免疫學(xué)病因. 內(nèi)分泌外科雜志 2008； 2（4）: 276-279

6 李蘭群， 李海松， 郭軍， 等. 慢性前列腺炎中醫(yī)證型臨床調(diào)查. 中華中醫(yī)藥雜志 2011； 26（3）: 451-454

7 常德貴， 陳海， 張培海， 等. 增瀑顆粒治療氣滯血瘀型慢性前列腺炎的臨床研究. 中國男科學(xué)雜志 2009； 23（9）: 47-50

8 魏武然， 張唯力， 戴君勇. 大鼠慢性非細菌性前列腺炎模型的建立. 中國男科學(xué)雜志 2006； 20（1）: 22-24

9 郭應(yīng)祿， 胡禮泉. 主編. 男科學(xué). 北京: 人民衛(wèi)生出版社，2004: 3

10 白志明. 慢性前列腺炎研究進展. 海南醫(yī)學(xué) 2006；17（12）: 126-128

11 李宏軍. 慢性前列腺炎的病因?qū)W、分類及病理. 醫(yī)學(xué)新知雜志 2006； 16（2）: 63-69

12 Mosmann TR， Cherwinski H， Bond MW， et al. Two types of murine helper T cell clon . I. Definition according to pro les of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol 1986； 136（7）: 2348-2357

13 周曉輝， 韓蕾， 周智恒， 等. 免疫性慢性非細菌性前列腺炎大鼠模型的形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)特性. 中華男科學(xué)雜志 2005； 11（4）: 290-295

14 Galbiati S， Smid M， Gambini D， et a1. Fetal DNA detection in maternal plasma throughout gestation. Hum Genet 2005； 117（2-3）: 243-248

15 曾慶琪. 慢性前列腺炎病因病機探析. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報 2005； 21（3）: 140-142

（2015-05-21收稿）

Therapeutic effect analysis of Qian Mi Tong on chronic nonbacterial prostatitis based on the balance of Th1/Th2 cells*

Li Guangsen1， Chang Degui1，2， Zhang Peihai3， You Yaodong4， Zhong Zhendong5，Yu Xujun2， Chen Diang1， An Zhitao5， Mei Xuefeng1， Cai Jian1**， Bi Mingshuai1**
1. Department of Andrology， Teaching Hospital of Chengdu University of T.C.M， Chengdu 610072， China；
2. Department of Andrology， the Second Teaching Hospital of Chengdu University of T.C.M ； 3. Sichuan Integrative Medicine Hospital； 4. Chengdu University of T.C.M； 5. Department of Pathology， Sichuan Provincial People's Hospital

Cai Jian， E-mail: cireleface1978@163.com； Bi Mingshuai， E-mail: 26469830@qq.com

Objective To explore therapeutic effects of Qian Mi Tong on chronic nonbacterial prostatitis based on the balance of Th1/Th2 cells. Methods A total of 60 SD rats were randomly divided into six groups such as the control group，the model group， positive group and Qian Mi Tong high /medium/low dose group， 10 rats each group. The rat models with chronic nonbacterial prostatitis were established in all groups except the blank group. The rat models in the positive group were intragastrically administrated with Qian Lie Tong Yu capsule. The rat models in qian Mi Tong high /medium/low dose group were intragastrically administrated with qian Mi Tong tablet， and the rats in the control group with normal saline. The forced feeding lasted for 4 weeks. The rats were killed by femoral artery cutting twenty four hours after last time forcd feeding. Pathological changes in prostatic tissue were observed under the light microscope and the expressions of the IFN-γ and IL-4 were measured by immunohistochemistry. Results Compared with that of the model group， tissue in ammationwas signi cantly reduced in Qian Mi Tong high /medium dose group. There is an obvious decrease in expressions of IFN-γ and IL-4 in Qian Mi Tong high dose group （P＜0.01） and also decrease in IL-4 content in Qian Mi Tong medium/low dose group （P＜0.01）. The ratio of IFN- γ/IL-4 was signi cantly increased in Qian Mi Tong high /medium/low dose group （P＜0.01）. Conclusion Qian Mi Tong can relieve the tissue inflammation of rats with chronic nonbacterial prostatitis，downregulate the IFN-γ and IL-4 expression，and increas the ratio of IFN- γ/IL-4.

Qian Mi Tong； prostatitis； Th1cells； Th2 cells

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.08.003

R 697.33

資助: 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院科技基金項目（編號：2011-D-YY-22）

**共同通訊作者: 蔡 劍， E-mail: cireleface1978@163.com； 畢明帥， E-mail: 26469830@qq.com