樹突狀細胞在無精子癥睪丸組織中的免疫表型分析*

鄭文忠 陳劍波 張恩溥 劉 沖 李明華 段永剛 桂耀庭 李賢新** . 北京大學深圳醫院泌尿外科， 廣東省男性生殖與遺傳實驗室（深圳 5806）. 北京大學深圳醫院婦產科； . 深圳市第二人民醫院（深圳大學第一附屬醫院）生殖醫學中心

·論 著·

樹突狀細胞在無精子癥睪丸組織中的免疫表型分析*

鄭文忠1陳劍波1張恩溥1劉 沖2李明華1段永剛3桂耀庭1李賢新1**1. 北京大學深圳醫院泌尿外科， 廣東省男性生殖與遺傳實驗室（深圳 518036）
2. 北京大學深圳醫院婦產科； 3. 深圳市第二人民醫院（深圳大學第一附屬醫院）生殖醫學中心

目的 探討樹突狀細胞（Dendritic cell， DC）在非梗阻性無精子癥患者睪丸中的免疫表型及其分子機制。方法 采用免疫組織化學染色法檢測10例正常人及25例無精子癥患者睪丸中CD3，CD1a，CD11c，CD123，DC-SIGN （DC-speci c ICAM-grabbing non-integrin），CD83，HLA-DR表達水平，并進行體視學分析。結果 正常組及無精子癥組均有CD1a、CD11c、DC-SIGN、HLA-DR表達，并主要分布于睪丸間質。無精子癥組CD1a、CD11c、DCSIGN、HLA-DR表達水平較正常組顯著增高，差異有顯著性（P＜0.05）。正常組無CD123及CD83表達，無精子癥組CD123、CD83高表達。結論 非梗阻性無精子癥患者睪丸中CD1a+朗格漢斯細胞（Langerhans cell，LC）、DCSIGN+間質型DC（Stromal DC）、CD123+漿細胞樣DC（Plasmacytoid DC，pDC）及CD11c+髓樣DC（Myeloid DC，mDC）表達水平顯著增高并趨向分化成熟，提示DC在無精子癥發生發展過程中可能起重要作用。

無精子癥； 樹突細胞； 免疫表型分型

無精子癥是男性不育常見原因中最為嚴重的一種類型，男性不育中約占10%［1］。近期研究表明，睪丸炎癥性疾病是引起精子發生異常的主要因素之一［2-4］。其致病機制可能為炎性細胞浸潤及諸多細胞因子超高水平釋放，導致血-睪屏障受損，損害生精上皮導致精子發生異常［5］。前期研究發現，樹突狀細胞（Dendritic cell， DC）可通過誘導Th17細胞（T helper17 cell）極化，產生白細胞介素17 （interleukin-17， IL-17）等細胞因子損傷生精上皮，進而引起無精子癥［5］。本實驗通過免疫組織化學技術檢測不同DC亞群［朗格漢斯細胞（Langerhans cell，LC），間質型DC（Stromal DC， sDC），漿細胞樣DC （Plasmacytoid DC， pDC）及髓樣DC（Myeloid DC，mDC）］在正常及無精子癥患者睪丸組織中的分布及表達，并探討DC在非梗阻性無精子癥中的作用。

材料與方法

一、標本收集制備

篩選符合研究標準無精子癥患者睪丸病理標本共25例，正常睪丸標本共10例，年齡30～55歲，登記病例資料（感染史、用藥史、其他治療史、配偶情況和生育史等）、篩選標準和診斷標準，填寫知情同意書。正常睪丸標本選自2009年至2012年我院泌尿外科因前列腺癌而接受睪丸去勢手術治療的患者，并經2名病理科醫師同時診斷為正常睪丸組織。無精子癥睪丸病理標本選自2011年至2014年我院泌尿外科因3次精液檢查中未見精子而診斷為無精子癥而接受睪丸活檢者，經CD3免疫組織化學染色、精漿中性α葡萄糖苷酶測定及2名病理科醫師同時確定其為炎性非梗阻性無精子癥。標本均經4%多聚甲醛固定處理并由常規石蠟包埋備用。

二、主要試劑及儀器

CD3鼠抗人單抗（福州邁新公司）；CD1a 鼠抗人多抗（Abcam，UK）；CD11c鼠抗人多抗（武漢三鷹公司）；CD123鼠抗人單抗（福州邁新公司）；DC-SIGN兔抗人多抗（Abcam，UK）；CD83鼠抗人多抗（Abcam，UK）；HLA-DR鼠抗人單抗（Abcam，UK），UltraSensitiveTM SP（鼠/兔）試劑盒（福州邁新公司），DAB（福州邁新公司），萊卡顯微鏡DM 4000 b。

三、免疫組織化學染色（二步法）

經石蠟包埋標本連續切片，片厚為5μm，烘干處理后備用。經二甲苯脫蠟，梯度酒精水化處理。0.3%過氧化氫孵育20min，pH 10.0 Tris-EDTA微波修復20min，自然冷卻至室溫。山羊血清室溫孵育60min，一抗4℃過夜，二抗37℃溫箱孵育45min，DAB（棕黃）顯示，經蘇木紫復染細胞核，水化，透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察染色結果。陰性對照用相應IgG替代一抗。

四、統計學方法

對免疫組化圖像采集者實施盲法，每個標本病變典型處采集10個高倍視野（HPF×200）。安排2名未參與實驗設計人員計數每相同高倍視野中陽性細胞數，并相互確認結果間差異無顯著性（P＞0.05）。另安排1名未參與實驗設計人員統計分析實驗結果，方法為以10個高倍視野下陽性細胞均數代表該樣本中DC特異性標志物表達水平。正常組與無精子癥組采用樣本均數間 t 檢驗進行分析，每組實驗數據以±s表示，統計軟件為R 3.0.1，P＜0.05為差異有顯著性。

結 果

一、CD1a在正常及無精子癥患者睪丸中的分布及表達

正常及無精子癥患者CD1a+ LC主要分布于睪丸間質，且無精子癥患者CD1a+ LC顯著增加（圖 1）。正常組及無精子癥組中CD1a表達水平分別為（11.18±4.73）個/HPF、（103.56±26.12）個/HPF。組間差異有顯著性（P＜0.01）。

二、CD11c在正常及無精子癥患者睪丸中的分布及表達

正常及無精子癥患者CD11c+ mDC主要分布于睪丸間質，且無精子癥患者CD11c+ mDC顯著增加并向生精小管腔內浸潤（圖1）。正常組、無精子癥組中CD11c表達水平分別為（15.22±9.71）、（202.6±28）個/HPF。組間差異有顯著性（P＜0.01）。

三、DC-SIGN在正常及無精子癥患者睪丸中的分布及表達

正常及無精子癥患者DC-SIGN+ DC主要分布于睪丸間質，且無精子癥患者DC-SIGN+ DC顯著增加并向生精小管腔內浸潤（圖1）。正常組、無精子癥組中DCSIGN表達水平分別為（16.79±3.79）、（86.67±17.57）個/HPF。組間差異有顯著性（P＜0.01）。

四、CD123在正常及無精子癥患者睪丸中的分布及表達

正常睪丸無CD123表達，無精子癥睪丸間質可見大量CD123+ pDC浸潤，其表達水平為（87.64±21.89）個/HPF（圖2）。

圖1 免疫組化分析CD1a、CD11c及DC-SIGN在睪丸組織中的表達（×200， ×400）A: 正常睪丸中CD1a的表達； B: 無精子癥患者睪丸中CD1a的表達； C: 兩者間CD1a陽性細胞數的比較； D: 正常睪丸中CD11c的表達； E: 無精子癥患者睪丸中CD11c的表達； F: 兩者間CD11c陽性細胞數的比較； G: 正常睪丸中DC-SIGN的表達； H: 無精子癥患者睪丸中DC-SIGN的表達； I:兩者間DC-SIGN陽性細胞數的比較； 箭頭指向為陽性細胞

圖2 免疫組化分析CD123及CD83在睪丸組織中的表達（×200， ×400）A: 正常睪丸中無CD123的表達； B: 無精子癥患者睪丸中CD123的表達； C: 正常睪丸中無CD83表達； D: 無精子癥患者睪丸中CD83的表達；箭頭指向為陽性細胞

五、 CD83及HLA-DR在正常及無精子癥患者睪丸中的分布及表達

CD83常為DC分化成熟的標志，正常睪丸組織未見CD83表達，無精子癥睪丸間質中可見大量CD83+ DC浸潤，其表達水平為（82.09±23.78）個/HPF（圖2）。HLA-DR為主要組織相容性復合物（MHC）Ⅱ類分子，在DC及巨噬細胞中均有表達，并在炎癥DC中高表達。正常人及無精子癥患者睪丸均可見HLA-DR表達， 正常睪丸可見HLA-DR+細胞分布于間質及圍繞生精小管基底部呈環形分布。無精子癥患者睪丸間質中可見大量HLA-DR+細胞浸潤，圍繞生精小管基底部呈環形分布的HLA-DR+細胞顯著增加（圖3）。在正常組、無精子癥組中HLA-DR表達水平分別為（42.18±4.35）、（103.24±24.30）個/HPF。組間差異有顯著性（P＜0.01）。

圖3 免疫組化分析HLA-DR在睪丸中的表達（×200，×400）A: 正常睪丸中HLA-DR的表達情況； B: 無精子癥患者睪丸中HLA-DR的表達； C: 兩者間HLA-DR陽性細胞數的比較； 箭頭指向為陽性細胞

討 論

無精子癥病因復雜，可將其分為梗阻性無精子癥及非梗阻性無精子癥。梗阻性無精子癥系指精子排出受阻，患者睪丸生精功能正常，而遠側精子排出管道受阻。非梗阻性無精子癥系指睪丸生精功能異常，無法產生精子。近期研究表明免疫因素在非梗阻性無精子癥致病過程中起重要作用［4，5］。本實驗采用免疫組織化學方法分析正常及無精子癥患者睪丸組織中的DC分布，發現DC在無精子癥患者睪丸中顯著增加，提示DC在無精子癥患者睪丸免疫損傷發生發展過程中可能起關鍵作用。

DC是抗原提呈功能最強的一種抗原提呈細胞，為連接固有免疫及適應性免疫的“橋梁”，是機體產生適應性T淋巴細胞免疫應答的始動者［6-8］。根據其來源、分布、分化狀態及功能可分為：mDC、pDC、LC、間質性DC、成熟性DC、未成熟性DC、耐受性DC及炎癥性DC［9］。

CD1a是一類呈遞脂類抗原的分子，是LC特征性標記物。LC主要分布于表皮組織中，在對抗病原微生物侵入皮膚及免疫監視腫瘤細胞中起重要作用［10］。本研究發現正常及無精子癥患者睪丸中均有CD1a+ LC表達，且無精子癥患者睪丸組織中CD1a+ LC顯著增加。推測其作用機制可能為睪丸炎引起細胞壞死凋亡，募集大量LC浸潤病灶組織，并通過向T淋巴細胞提呈抗原表位，進而對睪丸產生免疫損傷。本項目組前期研究發現，無精子癥患者睪丸中mDC較正常人顯著增高，并可通過釋放白細胞介素23（interleukin-23， IL-23）誘導幼稚型T淋巴細胞向Th17細胞分化，進而打破Th17細胞與調節性T細胞（Regulatory cell，Treg ）間的免疫平衡，Th17細胞通過產生IL-17等細胞因子進而對生精子細胞產生免疫損傷［5］。與前期研究一致，本研究發現無精子癥患者睪丸中CD11c+ mDC數量顯著增加并向生精小管腔內浸潤，表明CD11c+ mDC在啟動Th17細胞產生免疫殺傷中可能發揮關鍵作用。

DC-SIGN（DC-specific ICAM-grabbing nonintegrin）是Ⅱ型跨膜受體，為DC表面C型凝集素受體（CLRs）的主要成員，通過識別HIV包膜蛋白（gp120）捕獲HIV病毒，并將病毒傳遞給T淋巴細胞［11］。近期研究發現睪丸間質少量分布DC-SIGN+ DC，并在HIV持續感染中發揮重要作用［12］。DCSIGN+ DC在慢性睪丸炎及無精子癥中的作用至今仍無相關報道，本實驗發現無精子癥患者睪丸組織大量浸潤DC-SIGN+ DC，部分DC-SIGN+ DC可穿透血-睪丸屏障，并向生精小管及其腔內擴散。DC-SIGN為間質型DC的特征性標記，常在成熟型DC中表達［13，14］。實驗結果提示炎癥后期DC-SIGN+ DC可能在睪丸免疫損傷中發揮重要作用。

正常條件下，pDC主要分布于外周血及次級淋巴器官。pDC對外源性抗原攝取能力較弱，主要通過其細胞表面的TLR7（Toll-like receptors 7）及TLR9提呈內源性抗原，并通過分泌I型干擾素活化自然殺傷細胞（Nature killer cell，NK）、CD8+T及CD4+T細胞，進而發揮免疫防御作用。睪丸作為機體免疫豁免區，其間有多種免疫細胞，而至今仍無pDC在睪丸中的相關報道。本實驗未見正常睪丸表達CD123+ pDC，而無精子癥患者睪丸組織可見大量CD123+ pDC炎性浸潤，說明pDC在無精子癥發生發展過程中可能發揮重要的作用。

CD83常視為DC分化成熟的標志［15］。本研究未見其在正常睪丸組織中表達，而無精子癥睪丸間質中可見大量CD83+ DC浸潤。HLA-DR常在炎性DC中高表達，我們研究發現正常睪丸大部分HLA-DR+細胞圍繞生精小管基底部呈環形分布，無精子癥患者睪丸間質中可見大量HLA-DR+細胞浸潤。CD83+ DC及HLA-DR+ DC在無精子癥患者睪丸中的高表達，說明炎癥狀態下，睪丸DC逐漸分化成熟，并打破耐受性DC與炎癥性DC之間的免疫平衡，炎癥性DC可進一步激活T淋巴產生免疫損傷作用［5，16］。

綜上所述，通過分析正常睪丸及無精子癥睪丸組織中各DC亞群的改變，本實驗發現正常睪丸組織中DC主要表現為未成熟型，說明其可能在維系睪丸免疫微環境及免疫調節中發揮重要作用。在無精子癥患者睪丸組織中，LC、sDC、mDC及pDC表達水平顯著增高，且主要表現為成熟型的炎性DC，提示在非梗阻性無精子癥發生發展過程中DC通過大量吞噬壞死及凋亡細胞并逐漸分化成熟，成熟DC可募集大量DC浸潤并促進炎癥的發展，進而對精子產生免疫損傷。本研究僅通過免疫組織化學染色檢測DC在非梗阻性無精子癥中的免疫表型特征，進一步需通過Western blot及PCR驗證其在非梗阻性無精子癥中的表達差異，并將深入探討DC在非梗阻性無精子癥中的分子機制。

1 Zopfgen A， Priem F， Sudhoff F， et al. Relationship between semen quality and the seminal plasma components carnitine， alpha-glucosidase， fructose， citrate and granulocyte elastase in infertile men compared with a normal population. Hum Reprod 2000； 15（4）: 840-845

2 Weidner W， Krause W， Ludwig M. Relevance of male accessory gland infection for subsequent fertility with special focus on prostatitis. Hum Reprod Update 1999；5（5）: 421-432

3 Haidl G， Allam JP， Schuppe HC. Chronic epididymitis: impact on semen parameters and therapeutic options. Andrologia 2008； 40（2）: 92-96

4 Schuppe HC， Meinhardt A， Allam JP， et al. Chronic orchitis: a neglected cause of male infertility？ Andrologia 2008； 40（2）: 84-91

5 Duan YG， Yu CF， Novak N， et al. Immunodeviation towards a Th17 immune response associated with testicular damage in azoospermic men. Int J Androl 2011；34（6 Pt 2）: e536-545

6 Steinman RM， Cohn ZA. Identi cation of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology，quantitation， tissue distribution. J Exp Med 1973； 137（5）: 1142-1162

7 Steinman RM. Decisions about dendritic cells: past，present， and future. Ann Rev Immunol 2012； 30: 1-22

8 Novak N， Koch S， Allam JP， et al. Dendritic cells: bridging innate and adaptive immunity in atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol 2010； 125（1）: 50-59

9 段永剛， 秦曉峰， 蔡志明， 等. 樹突狀細胞在男性生殖系統中的作用. 醫學分子生物學雜志 2013； 10（4）: 238-243

10 Yu SH， Bordeaux JS， Baron ED. The immune system and skin cancer. Adv Exp Med Biol 2014； 810: 182-191

11 de Witte L， Nabatov A， Geijtenbeek TB. Distinct roles for DC-SIGN+-dendritic cells and Langerhans cells in HIV-1 transmission. Trends Mol Med 2008； 14（1）: 12-19

12 Shehu-Xhilaga M， Kent S， Batten J， et al. The testis and epididymis are productively infected by SIV and SHIV in juvenile macaques during the post-acute stage of infection. Retrovirology 2007；4:7.

13 Geijtenbeek TB， Torensma R， van Vliet SJ， et al. Identi cation of DC-SIGN， a novel dendritic cell-speci c ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell 2000； 100（5）: 575-585

14 Steinman RM. DC-SIGN: a guide to some mysteries of dendritic cells. Cell 2000； 100（5）: 491-49415 Zhou LJ， Tedder TF. Human blood dendritic cells selectively express CD83， a member of the immunoglobulin superfamily. J Immunol 1995； 154（8）: 3821-3835

16 Ohman J， Magnusson B， Telemo E， et al. Langerhans cells and T cells sense cell dysplasia in oral leukoplakias and oral squamous cell carcinomas--evidence for immunosurveillance. Scand J Immunol 2012； 76（1）: 39-48

（2015-07-01收稿）

Immunophenotype analysis of dendritic cells in testicular tissues of azoospermia patients*

Zheng Wenzhong1， Chen Jianbo1， Zhang Enpu1， Liu Chong2，Li Minghua1， Duan Yonggang3， Gui Yaoting1， Li Xianxin1**1. Department of Urology， Peking University Shenzhen Hospital； Guangdong Key Labrotory of Male Reproductive and
Genetic， Shenzhen Guangdong 518036， China；
2. Department of Gynaecology and Obstetrics， Peking University Shenzhen Hospital； 3. Reproductive Medicine Center，Shenzhen Second People's Hospital （The First Af liated Hospital of Shenzhen University）

Objective To investigate the immunophenotype of dendritic cells （DC） in testicular tissues of azoospermia patients and explore its roles in development of azoospermia. Methods The expressions of DC specific marker CD1a，CD11c， CD123， DC-SIGN（DC-speci c ICAM-grabbing non-integrin）， CD83， HLA-DR were comparatively analyzed in 25 testicular tissues of azoospermia patients and 10 normal testicular tissues. Results The expressions of CD1a+， CD11c+， DCSIGN+ and HLA-DR+ DC were found in all normal and azoospermia testicular tissues， and most of them were located in interstitial tissue of testis. The number of DC with CD1a+， CD11c+， DC-SIGN+ and HLA-DR+ were signi cantly increased in testicular tissues of azoospermia patients as compared with that of normal testicular tissues. No expression of CD123+ and CD83+ DC was found in normal testicular tissues， but， CD83+ mature DC and CD123+ Plasmacytoid DC （pDC）were signi cantly increased in testicular tissues of azoospermia and there was a statistical signi cance among these groups（P＜0.05）. Conclusion CD1a+ Langerhans cells （LCs）， DC-SIGN+ Stromal DC， CD123+ pDCs and CD11c+ Myeloid DC （mDC） were signi cantly increased and associated with the development of a mature phenotype in testicular tissues of azoospermia， indicating that these DC subtypes may play an important role in the development of azoospermia.

azoospermia； Dendritic Cells； immunophenotyping

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.08.001

R 698.2

資助: 國家自然科學基金（No.No.81572513）、廣東省自然科學基金（S2012010008200）、深圳市科技創新委員會基礎研究計劃（JCYJ20150403091443334）

**通信作者， E-mail: xianxinli@163.com