不同產(chǎn)地黃藥子中黃獨(dú)乙素的含量測(cè)定

沈雄榮，董建勇

(溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)系，溫州 325035)

黃藥子為薯蕷科植物黃獨(dú)(Dioscorea bulbiferaL.)的塊莖，隨著其被廣泛應(yīng)用于臨床而且在治療某些頑疾過(guò)程中有獨(dú)特的療效，黃藥子毒性引起國(guó)內(nèi)學(xué)者廣泛關(guān)注，有文獻(xiàn)報(bào)道黃藥子及其制劑相關(guān)的安全性［1-9］。黃藥子的肝臟毒性成分目前尚不清楚，一般認(rèn)為主要是薯蕷皂苷元和薯蕷毒皂苷元，但近幾年研究［10-13］發(fā)現(xiàn)，其所含二萜內(nèi)酯類(lèi)成分是黃藥子藥理作用的主要有效成分和毒性成分，其中黃獨(dú)乙素為主要物質(zhì)。筆者在本實(shí)驗(yàn)中選取不同產(chǎn)地黃藥子，采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定黃藥子中黃獨(dú)乙素含量，以期為安全用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國(guó)Waters高效液相色譜系統(tǒng)(515泵，996DAD檢測(cè)器，Empower2色譜系統(tǒng));Kromasil-C18柱(4.6mm ×250mm，5 μm);日本 AND GH-202 電子分析天平(日本AND公司)。

1.2 試藥 乙腈(色譜純，Merck公司);甲醇(色譜純，Merck公司);水(自制超純水);醋酸(分析純，上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司)。黃獨(dú)乙素對(duì)照品購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司，含量≥98%;黃藥子:產(chǎn)地廣西，購(gòu)自浙江省湖州市獅象龍大藥房;產(chǎn)地四川，購(gòu)自浙江省湖州市寶芝林大藥房;產(chǎn)地浙江，購(gòu)自浙江省湖州市慕韓齋藥業(yè)有限公司;產(chǎn)地河北，購(gòu)自廣州市大參林藥店;產(chǎn)地江蘇，購(gòu)自南京市同仁堂藥店。經(jīng)浙江省湖州市藥品檢驗(yàn)所陳敏中藥師鑒定為薯蕷科植物黃獨(dú)(Dioscorea bulbiferaL.)的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 用DAD二極管陣列檢測(cè)器分析黃獨(dú)乙素對(duì)照品色譜峰和黃藥子樣品中所測(cè)成分相應(yīng)色譜峰的紫外光譜，結(jié)果紫外光譜基本一致，均在210 nm處有最大吸收，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

2.2 色譜條件 流動(dòng)相:乙腈∶水(0.1%醋酸)=34∶66，流速為 1.0mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng) 210 nm，柱溫35℃，在此色譜條件下，黃獨(dú)乙素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖見(jiàn)圖1，供試品HPLC圖見(jiàn)圖2。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 取黃獨(dú)乙素對(duì)照品6.50 mg精密稱(chēng)定，置25mL量瓶，加甲醇溶解，稀釋至刻度，得260 μg·mL－1對(duì)照品儲(chǔ)備液，4℃冰箱放置。

2.4 供試品溶液的制備 取不同產(chǎn)地黃藥子粉末各5.0 g精密稱(chēng)定，裝入小布袋，縫合，用紗布包裹，一煎加水500mL，浸泡0.5 h，煎煮 1 h，二煎 300mL，煎煮0.5 h，合并水煎液放置至室溫，定容250mL，取少許，經(jīng)孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

1，2.溶劑;3.黃獨(dú)乙素圖1 黃獨(dú)乙素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖1，2.solvent;3.diosbulbin BFig.1 HPLC chromatogram of diosbulbin B standard

1.黃獨(dú)乙素圖2 黃藥子供試品HPLC色譜圖1.diosbulbin BFig.2 HPLC Chromatogram of dioscorea bulbifera L.sample

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精密量取黃獨(dú)乙素對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0，2.0，3.0，5.0mL 分別置 10mL 量瓶，分別加甲醇至刻度，搖勻，使?jié)舛纫来螢?6，52，78，130 μg·mL－1。分別取稀釋液和儲(chǔ)備液各 20 μL，進(jìn)樣，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得黃獨(dú)乙素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):Y=17 850X+5 378.2，r=0.999 9，線(xiàn)性范圍:26.0 ～130.0 μg·mL－1。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取同一份對(duì)照品溶液(黃獨(dú)乙素濃度為130 μg·mL－1)，分別進(jìn)樣6次，每次20 μL，記錄黃獨(dú)乙素峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果RSD為0.84%，表明該方法精密度良好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按“2.4”項(xiàng)制備產(chǎn)地為河北黃藥子水煎液6份，每份進(jìn)樣3針，計(jì)算黃獨(dú)乙素的含量，含量平均值為2.917 mg·g－1，結(jié)果 RSD 為1.73%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別取同一份水煎液(產(chǎn)地河北)供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8，12，24 h 精密吸取40 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，考察其穩(wěn)定性。根據(jù)黃獨(dú)乙素含量，計(jì)算RSD為0.26%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 采用加樣回收法，取適量已知含量(2.938 mg·g－1)的產(chǎn)地河北的黃藥子粉末6份精密稱(chēng)定，精密加入黃獨(dú)乙素對(duì)照品適量，按“2.4”項(xiàng)方法制備水煎液6份，作為供試品溶液，測(cè)定和計(jì)算回收率。平均回收率100.0%，RSD為0.50%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃獨(dú)乙素加樣回收率結(jié)果Tab.1 Recovery of Diosbulbin B n=6

2.10 樣品含量測(cè)定 分別取5個(gè)不同產(chǎn)地烘至恒重的黃藥子粉末5.000 g精密稱(chēng)定，按“2.4”項(xiàng)制備供試品溶液，精密吸取每個(gè)供試品溶液40 μL，進(jìn)樣3次，以3次測(cè)得的平均值計(jì)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算各供試品中黃獨(dú)乙素的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

筆者在本實(shí)驗(yàn)采用二次水煎、合并水煎液直接定容的方法。該法簡(jiǎn)單方便，也和中藥飲片水煎和含黃藥子中成藥沖水服用的方法一致，能更好地定量其中黃獨(dú)乙素含量。筆者采用將黃藥子粉末裝入小藥袋封口，再用紗布輕輕包裹后水煎，水煎液清澈，幾乎無(wú)雜質(zhì)，用紗布濾過(guò)一次不會(huì)有廢渣堵住漏斗口，原液量幾乎無(wú)浪費(fèi)，不同批次間含量測(cè)定穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。

筆者做預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定浙江產(chǎn)黃藥子中黃獨(dú)乙素含量時(shí)，剛開(kāi)始選用的色譜條件為:乙腈∶水(0.1%醋酸)=40∶60，25℃，出峰時(shí)間約9min，經(jīng)峰純度檢驗(yàn)不純。后來(lái)流動(dòng)相為乙腈∶水(0.1%醋酸)=34∶66，25℃，兩物質(zhì)能基線(xiàn)分離，但分離度不好，T1=13.718，T2=14.194。最后選定乙腈∶水(0.1%醋酸)=34∶66，35℃，出峰時(shí)間適當(dāng)，分離度良好，峰1出峰時(shí)間與黃獨(dú)乙素標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間接近，為黃獨(dú)乙素，后面的峰經(jīng)光譜分析，和黃獨(dú)乙素光譜圖極其相似，筆者推測(cè)為黃獨(dú)乙素的類(lèi)似物。

表2 不同產(chǎn)地黃藥子中黃獨(dú)乙素含量Tab.2 Diosbulbin B content in Dioscorea bulbifera L.from different habitats

不同產(chǎn)地黃獨(dú)乙素含量測(cè)定的結(jié)果(除浙江產(chǎn)地外)為2 ～3 mg·g－1，與文獻(xiàn)［14-15］報(bào)道一致，但也有差異，黃獨(dú)乙素平均含量:河北＞廣西＞江蘇＞四川＞浙江，這可能與黃藥子產(chǎn)地、炮制方法、不同批次等有關(guān)。假設(shè)浙江產(chǎn)黃藥子中黃獨(dú)乙素類(lèi)似物以黃獨(dú)乙素含量來(lái)計(jì)算，兩者加起來(lái)含量2～3 mg·g－1。有關(guān)黃獨(dú)乙素類(lèi)似物的臨床藥理和毒性鮮見(jiàn)報(bào)道，有待進(jìn)一步關(guān)注和研究。

筆者選取不同產(chǎn)地黃藥子，測(cè)定其中有效成分且同為毒性成分黃獨(dú)乙素的含量，為黃藥子臨床量-效-毒關(guān)系研究以及效-毒的最優(yōu)劃界點(diǎn)提供一定幫助，為臨床用藥提供參考。

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