不同產地黃藥子中黃獨乙素的含量測定

沈雄榮，董建勇

(溫州醫科大學藥學院藥學系，溫州 325035)

黃藥子為薯蕷科植物黃獨(Dioscorea bulbiferaL.)的塊莖，隨著其被廣泛應用于臨床而且在治療某些頑疾過程中有獨特的療效，黃藥子毒性引起國內學者廣泛關注，有文獻報道黃藥子及其制劑相關的安全性［1-9］。黃藥子的肝臟毒性成分目前尚不清楚，一般認為主要是薯蕷皂苷元和薯蕷毒皂苷元，但近幾年研究［10-13］發現，其所含二萜內酯類成分是黃藥子藥理作用的主要有效成分和毒性成分，其中黃獨乙素為主要物質。筆者在本實驗中選取不同產地黃藥子，采用高效液相色譜(HPLC)法測定黃藥子中黃獨乙素含量，以期為安全用藥提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國Waters高效液相色譜系統(515泵，996DAD檢測器，Empower2色譜系統);Kromasil-C18柱(4.6mm ×250mm，5 μm);日本 AND GH-202 電子分析天平(日本AND公司)。

1.2 試藥 乙腈(色譜純，Merck公司);甲醇(色譜純，Merck公司);水(自制超純水);醋酸(分析純，上海強順化學試劑有限公司)。黃獨乙素對照品購于四川省維克奇生物科技有限公司，含量≥98%;黃藥子:產地廣西，購自浙江省湖州市獅象龍大藥房;產地四川，購自浙江省湖州市寶芝林大藥房;產地浙江，購自浙江省湖州市慕韓齋藥業有限公司;產地河北，購自廣州市大參林藥店;產地江蘇，購自南京市同仁堂藥店。經浙江省湖州市藥品檢驗所陳敏中藥師鑒定為薯蕷科植物黃獨(Dioscorea bulbiferaL.)的干燥根莖。

2 方法與結果

2.1 檢測波長的確定 用DAD二極管陣列檢測器分析黃獨乙素對照品色譜峰和黃藥子樣品中所測成分相應色譜峰的紫外光譜，結果紫外光譜基本一致，均在210 nm處有最大吸收，故確定檢測波長為210 nm。

2.2 色譜條件 流動相:乙腈∶水(0.1%醋酸)=34∶66，流速為 1.0mL·min－1，檢測波長 210 nm，柱溫35℃，在此色譜條件下，黃獨乙素標準品的HPLC圖見圖1，供試品HPLC圖見圖2。

2.3 對照品溶液的制備 取黃獨乙素對照品6.50 mg精密稱定，置25mL量瓶，加甲醇溶解，稀釋至刻度，得260 μg·mL－1對照品儲備液，4℃冰箱放置。

2.4 供試品溶液的制備 取不同產地黃藥子粉末各5.0 g精密稱定，裝入小布袋，縫合，用紗布包裹，一煎加水500mL，浸泡0.5 h，煎煮 1 h，二煎 300mL，煎煮0.5 h，合并水煎液放置至室溫，定容250mL，取少許，經孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

1，2.溶劑;3.黃獨乙素圖1 黃獨乙素標準品的HPLC圖1，2.solvent;3.diosbulbin BFig.1 HPLC chromatogram of diosbulbin B standard

1.黃獨乙素圖2 黃藥子供試品HPLC色譜圖1.diosbulbin BFig.2 HPLC Chromatogram of dioscorea bulbifera L.sample

2.5 標準曲線的繪制 精密量取黃獨乙素對照品儲備液1.0，2.0，3.0，5.0mL 分別置 10mL 量瓶，分別加甲醇至刻度，搖勻，使濃度依次為26，52，78，130 μg·mL－1。分別取稀釋液和儲備液各 20 μL，進樣，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標，以濃度為橫坐標進行線性回歸，得黃獨乙素的標準曲線:Y=17 850X+5 378.2，r=0.999 9，線性范圍:26.0 ～130.0 μg·mL－1。

2.6 精密度實驗 分別精密吸取同一份對照品溶液(黃獨乙素濃度為130 μg·mL－1)，分別進樣6次，每次20 μL，記錄黃獨乙素峰面積，計算RSD。結果RSD為0.84%，表明該方法精密度良好。

2.7 重復性實驗 按“2.4”項制備產地為河北黃藥子水煎液6份，每份進樣3針，計算黃獨乙素的含量，含量平均值為2.917 mg·g－1，結果 RSD 為1.73%，表明該方法重復性良好。

2.8 穩定性實驗 分別取同一份水煎液(產地河北)供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8，12，24 h 精密吸取40 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，考察其穩定性。根據黃獨乙素含量，計算RSD為0.26%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.9 加樣回收率實驗 采用加樣回收法，取適量已知含量(2.938 mg·g－1)的產地河北的黃藥子粉末6份精密稱定，精密加入黃獨乙素對照品適量，按“2.4”項方法制備水煎液6份，作為供試品溶液，測定和計算回收率。平均回收率100.0%，RSD為0.50%。結果見表1。

表1 黃獨乙素加樣回收率結果Tab.1 Recovery of Diosbulbin B n=6

2.10 樣品含量測定 分別取5個不同產地烘至恒重的黃藥子粉末5.000 g精密稱定，按“2.4”項制備供試品溶液，精密吸取每個供試品溶液40 μL，進樣3次，以3次測得的平均值計，用標準曲線法計算各供試品中黃獨乙素的含量。結果見表2。

3 討論

筆者在本實驗采用二次水煎、合并水煎液直接定容的方法。該法簡單方便，也和中藥飲片水煎和含黃藥子中成藥沖水服用的方法一致，能更好地定量其中黃獨乙素含量。筆者采用將黃藥子粉末裝入小藥袋封口，再用紗布輕輕包裹后水煎，水煎液清澈，幾乎無雜質，用紗布濾過一次不會有廢渣堵住漏斗口，原液量幾乎無浪費，不同批次間含量測定穩定，數據可靠。

筆者做預實驗測定浙江產黃藥子中黃獨乙素含量時，剛開始選用的色譜條件為:乙腈∶水(0.1%醋酸)=40∶60，25℃，出峰時間約9min，經峰純度檢驗不純。后來流動相為乙腈∶水(0.1%醋酸)=34∶66，25℃，兩物質能基線分離，但分離度不好，T1=13.718，T2=14.194。最后選定乙腈∶水(0.1%醋酸)=34∶66，35℃，出峰時間適當，分離度良好，峰1出峰時間與黃獨乙素標準品出峰時間接近，為黃獨乙素，后面的峰經光譜分析，和黃獨乙素光譜圖極其相似，筆者推測為黃獨乙素的類似物。

表2 不同產地黃藥子中黃獨乙素含量Tab.2 Diosbulbin B content in Dioscorea bulbifera L.from different habitats

不同產地黃獨乙素含量測定的結果(除浙江產地外)為2 ～3 mg·g－1，與文獻［14-15］報道一致，但也有差異，黃獨乙素平均含量:河北＞廣西＞江蘇＞四川＞浙江，這可能與黃藥子產地、炮制方法、不同批次等有關。假設浙江產黃藥子中黃獨乙素類似物以黃獨乙素含量來計算，兩者加起來含量2～3 mg·g－1。有關黃獨乙素類似物的臨床藥理和毒性鮮見報道，有待進一步關注和研究。

筆者選取不同產地黃藥子，測定其中有效成分且同為毒性成分黃獨乙素的含量，為黃藥子臨床量-效-毒關系研究以及效-毒的最優劃界點提供一定幫助，為臨床用藥提供參考。

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