微波輻射對(duì)雄性小鼠生殖系統(tǒng)的影響*

萬(wàn) 朋 高俊濤 王春艷 謝 維 呂士杰

1. 吉林醫(yī)藥學(xué)院生理學(xué)教研室（吉林 132013）； 2. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室

微波輻射對(duì)雄性小鼠生殖系統(tǒng)的影響*

萬(wàn) 朋1高俊濤1王春艷1謝 維1呂士杰2**

1. 吉林醫(yī)藥學(xué)院生理學(xué)教研室（吉林 132013）； 2. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室

目的 觀察微波輻射對(duì)雄性小鼠生殖系統(tǒng)的影響，并初步探討其作用機(jī)制。方法 將48只雄性昆明小鼠隨機(jī)分成微波輻射低、中、高強(qiáng)度組（微波輻射功率密度分別為5、10、15mW/cm2強(qiáng)度）和對(duì)照組，對(duì)小鼠輻射1h/d，連續(xù)30d。微波輻射結(jié)束后進(jìn)行小鼠性行為能力的觀察撲捉潛伏期（capture incubation period，CIP）、撲捉次數(shù)（capture times，CT）、精子相對(duì)計(jì)數(shù)、精子畸形數(shù)、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）等指標(biāo)的檢測(cè)。結(jié)果 15mW/cm2強(qiáng)度輻射后15d小鼠的撲捉潛伏期顯著延長(zhǎng)、撲捉次數(shù)顯著減少（P＜0.05），10mW/cm2強(qiáng)度輻射后30d小鼠的撲捉潛伏期顯著延長(zhǎng)、撲捉次數(shù)顯著減少（P＜0.05）；精子相對(duì)計(jì)數(shù)明顯減少（P＜0.05）；精子畸形率明顯增加（P＜0.05）；血清和睪丸組織中SOD的活性顯著降低（P＜0.05）；血清和睪丸組織中MDA的含量顯著增加（P＜0.05）；5mW/cm2強(qiáng)度輻射組上述各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組相比均未見(jiàn)明顯變化。結(jié)論低功率微波輻射可對(duì)雄性小鼠生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響，其作用機(jī)制可能與生殖細(xì)胞的氧化損傷有關(guān)。

微波； 精子； 超氧化物歧化酶； 丙二醛； 小鼠

手機(jī)微波輻射能顯著影響附睪上皮細(xì)胞的凋亡和數(shù)量，同時(shí)使睪丸激素顯著減少［7］。因此，本實(shí)驗(yàn)擬利用不同頻率的微波輻射小鼠動(dòng)物模型，在小鼠的生精期內(nèi)在不同的時(shí)間點(diǎn)，分別從血清和組織中氧化應(yīng)激水平和小鼠性行為能力等方面來(lái)研究不同強(qiáng)度微波輻射對(duì)雄性小鼠生殖系統(tǒng)的時(shí)間毒性。初步探討低功率微波輻射對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的影響機(jī)制，為微波輻射對(duì)生殖系統(tǒng)的影響提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

選用昆明小鼠48只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫（20±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%，體質(zhì)量（20±2）g，由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4個(gè)組，微波輻射低、中、高強(qiáng)度組（微波輻射功率密度分別為5、10、15mW /cm2）和正常對(duì)照組。

二、微波輻射模型的制備

微波輻照裝置：微波信號(hào)發(fā)生器，出口天線為矩形喇叭天線，功率峰值2MW。小鼠輻照時(shí)，將小鼠放置于30cm×30cm高為15cm自制的有機(jī)玻璃盒中，上面是帶有多個(gè)通氣孔的蓋，不含金屬物質(zhì)，矩形喇叭天線置于被照小鼠的正下方，照射參考點(diǎn)為小鼠腹部體表，電磁波電場(chǎng)方向與小鼠的長(zhǎng)軸平行。照射的平均功率密度分別為5、10、15mW/cm2，照射時(shí)間1h/d，連續(xù)照射30d，對(duì)照組除不接受微波輻射外，其他處理與輻射組相同，微波輻射實(shí)驗(yàn)室的反射基本為零。

三、相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

（一）性行為能力的觀察

分別于輻射的第15天和第30天，參照Anders Agmo［8］方法進(jìn)行，在安靜的室內(nèi)分別將每組的每只雄性小鼠放置于50cm×35cm×20cm的干凈的大鼠籠中適應(yīng)5min，隨后投入到同批飼養(yǎng)的正常雌性小鼠形成1對(duì)1的配對(duì)，觀察30min。觀察放置雌性小鼠后，雄性小鼠的第一次撲捉時(shí)間即撲捉潛伏期，同時(shí)觀察雄性小鼠在30min內(nèi)對(duì)雌性小鼠的撲捉次數(shù)。

（二）精子相對(duì)計(jì)數(shù)測(cè)定

分別于輻射的15d和30d后，小鼠脫椎處死，取出雙側(cè)附睪，在盛有2mL生理鹽水（提前預(yù)熱至37℃）的潔凈培養(yǎng)皿中進(jìn)行剝離術(shù)，使儲(chǔ)存在附睪中的精子游離出來(lái)。剝離好的附睪放置37 ℃的恒溫箱中孵育15～20min，取出過(guò)濾（4層濾紙）至EP試管。用移液槍取出100μL的精液，加入3%的NaCl 溶液100μL固定，輕輕混勻后取適量滴加至紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，在顯微鏡下計(jì)數(shù)精子數(shù)。計(jì)數(shù)原則：對(duì)于壓線精子，只計(jì)數(shù)精子頭，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。視精子密度而定，若精子密度高，則取1滴精液涂片即可。涂好的涂片自然風(fēng)干，待其干燥后，加入適量甲醇固定，待其干燥后，置于2%的伊紅染液中染色1h，染好后取出，細(xì)小流水輕輕沖洗，自然干燥后即可在顯微鏡下觀察。在低倍顯微鏡下找到背景清晰精子重疊較少的部位。用高倍顯微鏡順序檢查精子形態(tài)，每只小鼠檢查完整的精子500條。

（三）血清和睪丸組織SOD和MDA檢測(cè)

分別于輻射的15d和30d后，摘除小鼠的眼球取血，將血液置于肝素處理過(guò)的冰浴試管內(nèi)，將睪丸組織切碎勻漿，分別置于3 000×g的離心機(jī)內(nèi)離心30min，分別取血清和上清液，進(jìn)行氧化損傷指標(biāo)的檢測(cè)，SOD和MDA試劑盒均購(gòu)置于南京建成生物技術(shù)研究所，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

（四）數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均用±s表示。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析（one-way ANOVA），各樣本均數(shù)之間的多重比較采用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)，P＜0.05示為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、微波輻射對(duì)雄性小鼠性行為的影響

正常雄性小鼠在放置于雌性小鼠后（15.42±4.26）s開(kāi)始撲捉，在30 min內(nèi)撲捉雌鼠的次數(shù)可達(dá)（46.12±7.86）次；15mW/cm2強(qiáng)度輻射后15d后，雄性小鼠表現(xiàn)為少動(dòng)，撲捉潛伏期明顯延長(zhǎng)（27.35±9.46）s（P＜0.05），在30 min內(nèi)撲捉的次數(shù)也顯著減少（31.46±8.63）次（P＜0.05）；10mW/cm2強(qiáng)度輻射后30d小鼠的撲捉潛伏期顯著延長(zhǎng)、撲捉次數(shù)顯著減少（P＜0.05），見(jiàn)表1。

二、微波輻射對(duì)雄性小鼠精子的影響

分別于輻射的15d和30d后，取出雙側(cè)附睪，觀察微波輻射組小鼠與對(duì)照組小鼠的精子數(shù)量及精子的畸形率變化，結(jié)果顯示，精子相對(duì)計(jì)數(shù)明顯減少（P＜0.05）；精子畸形率明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 微波輻射15 d和30d后對(duì)雄性小鼠性行為的影響比較

表2 微波輻射15 d和30d后對(duì)雄性小鼠精子的影響比較

三、微波輻射對(duì)雄性小鼠組織和血清中SOD活性和MDA含量的影響

分別于輻射的15d和30d后，摘除小鼠的眼球取血收集血清，將睪丸組織切碎勻漿取上清液，取待測(cè)樣本嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，10、15mW/cm2強(qiáng)度微波輻射后與對(duì)照組相比，血清和睪丸組織中SOD的活性顯著降低（P＜0.05）（見(jiàn)圖1）；血清和睪丸組織中MDA的含量顯著增加（P＜0.05）（見(jiàn)圖2）。

圖1 微波輻射后小鼠血清和睪丸組織中SOD的活性與對(duì)照組相比顯著降低

圖2 微波輻射后小鼠血清和睪丸組織中MDA的含量與對(duì)照組相比顯著升高

討 論

微波輻射對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的影響，按其作用機(jī)制可分為熱效應(yīng)與非熱效應(yīng)。一般認(rèn)為，由于睪丸中血管相對(duì)缺乏，血流不暢，散熱比較困難，所以易出現(xiàn)過(guò)熱而造成睪丸損傷。大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，高頻率高輻射強(qiáng)度的微波輻射可對(duì)雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響，可引起精子活動(dòng)力下降，存活率降低，畸形率增加等［9］。Kesari 等［10］也有研究證實(shí)在精子形成過(guò)程中，微波照射后DNA在G（0）/G（1）無(wú)明顯不同，但在S期顯著下降，同樣證實(shí)了DNA 在G（2）/M 期的減少，并得出結(jié)論微波輻射可導(dǎo)致男性不育。之后，他又得出手機(jī)輻射所產(chǎn)生的活性氧（ROS）可使精子頭和精子體畸變，血清睪酮下降［11］和精子數(shù)目減少［12］。但是低強(qiáng)度長(zhǎng)時(shí)間的微波輻射對(duì)雄性生殖系統(tǒng)影響的研究報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)分別在微波輻射的第15天和第30天，進(jìn)行了小鼠的性行為觀察，并完成了精子相對(duì)計(jì)數(shù)和精子畸形率的分析，同時(shí)測(cè)定了睪丸組織和血清中SOD的活性以及MDA的含量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在微波輻射的過(guò)程中微波輻射可以隨時(shí)間和強(qiáng)度聚集，導(dǎo)致精子的相對(duì)數(shù)量減少而精子的畸形率增加，同時(shí)檢測(cè)了血清和睪丸組織中SOD活性顯著下降，MDA含量顯著增加。這些結(jié)果提示，微波輻射對(duì)雄性小鼠生殖系統(tǒng)的影響，其作用機(jī)制可能與生殖細(xì)胞的氧化損傷有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)也提醒人們?cè)谑褂猛ㄐ旁O(shè)備時(shí)，盡量減小頻率和縮短時(shí)間，降低微波輻射對(duì)人體生殖系統(tǒng)的影響。

1 Kesari KK， Behari J. Fifty-gigahertz microwave exposure effect of radiations on rat brain. Appl Biochem Biotech 2009； 158（1）： 126-319

2 Kesari KK， Behari J， Kumar S. Mutagenic response of 2.45GHz radiation exposure on rat brain. Intern J Rad Biol 2010； 86（4）： 334-343

3 Marinelli F， La Sala D， Cicciotti G， et al. Exposure to 900 MHz electromagnetic field induces an unbalance between pro-apoptotic and pro-survival signals in T-lymphoblastoid leukemia CCRF-CEM cells. J Cell Physiol 2004； 198（2）： 324-332

4 Zhao TY， Zou SP， Knapp PE. Exposure to cell phoneradiation up-regulates apoptosis genes in primary cultures of neurons and astrocytes. Neurosci Lett 2007； 412（1）： 34-38

5 Agarwal A， Deepinder F， Sharma RK， et al . Effect of cell phone usage on semen analysis in men attending infertility clinic： an observational study. Fertil Steril 2008； 89（1）： 124-128

6 Heynick LN， Merritt JH. Radiofrequency fields and teratogenesis. Bioelectromagnetics 2003； Suppl 6：S174-S186

7 Azadi Oskouyi E， Rajaei F， Safari Variani A， et al. Effects of microwaves （950 MHZ mobile phone） on morphometric and apoptotic changes of rabbit epididymis. Andrologia. 2015； 47（6）： 700-705

8 Anders Agmo. Male rat sexual behavior. Brain Res Protoc 1997； 1（2）： 203-209

9 Falzone N， Huyser C， Becker P， et al. The effect of pulsed 900-MHz GSM mobile phone radiation on the acrosome reaction， head morphometry and zona binding of human spermatozoa. Int J Androl 2011；34（1）：20-26

10 Kesari KK， Behari J. Microwave exposure affecting reproductive system in male rats.Appl Biochem Biotechnol 2010； 162（2）： 416-428

11 Kesari KK， Kumar S， Nirala J， et al. Biophysical evaluation of radiofrequency electromagnetic eld effects on male reproductive pattern. Cell Biochem Biophys 2013； 65（2）： 85-96

12 Kesari KK， Behari J. Evidence for mobile phone radiation exposure effects on reproductive pattern of male rats： role of ROS. Electromagn Biol Med 2012； 31（3）： 213-222

（2015-05-05收稿）

Effects of microwave radiation on reproductive system in male mice*

Wan Peng1， Gao JunTao1， Wang Chunyan1， Xie Wei1， Lv Shijie2**1. Department of Physiology， Jilin 132013， China， 2. Department of Biochemistry and Molecular Biology Corresponding author： Lv ShiJie， E-mail： lvshjie-qr@163.com

Objective To investigate the microwave radiation effects on reproductive system of male mice， and explore its mechanism. Methods Total of 48 male Kunming mice were randomly divided into control group and the microwave radiation groups with intensity5， 10， 15 mW/cm2. Mice in the groups received 1h/d radiation， 30 d. Sex ability of mice was evaluatedsuh as the capture incubation period （CIP）， the capture time （CT） after microwave， and the number of sperm count and sperm deformity， the superoxide dismutase （SOD）， and malondialdehyde （MDA） were also detected. Results Capture incubation period （CIP） of mice was prolonged and the capture time （CT） significantly was reduced（P＜0.05） under 15 mw/cm2intensity radiation for 15 d and 10 mw/cm2intensity radiation for 30 d. Relative sperm count and the activity of SOD in serum and testicular tissue were decreased signi cantly（P＜0.05）， whereas sperm malformation rate and the content of MDA in serum and testicular tissue was increased signi cantly （P＜0.05） under 15 mw/cm2intensity radiation for 15 d. All the above-mentioned indexes had no signi cant change compared with that of the control group with 5 mw/cm2radiation intensity. Conclusion Low-power microwave radiation can affect male reproductive system， and its mechanism may be related to oxidative damage in germ cells.

microwaves； spermatozoa； superoxid dismutase； malondialdehyde； mice

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.07.005

R 698.2； R 358.4

微波技術(shù)的迅猛發(fā)展使人們?cè)絹?lái)越多地暴露在電磁波的輻射之下，隨之而來(lái)的環(huán)境污染及人類健康問(wèn)題亦越來(lái)越引起人們重視。暴露的電磁波能對(duì)人體產(chǎn)生一定的副作用，甚至?xí)?dǎo)致生理功能的改變［1，2］。雄性生殖系統(tǒng)是微波輻射最敏感的靶部位之一，有研究證實(shí)，不同頻率的微波輻射可以引起細(xì)胞的增值，影響細(xì)胞的形態(tài)和功能以及細(xì)胞的凋亡［3，4］，高頻的微波輻射可以明顯影響睪丸組織和激素水平的變化從而增加不孕不育，微波輻射甚至導(dǎo)致流產(chǎn)和發(fā)育畸形［5，6］。

資助： 吉林省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)： WL201301）； 吉林省教育廳［吉教科合字（2013）第348號(hào)］**

， E-mail： lvshjie-qr@163.com