人前列腺癌細胞系PC-3再表達雄激素受體（AR）的腫瘤生物學特性研究及其意義*

劉 欣 曹靖晨 王海燕 鄂 群，張 沖 張永輝 陳苗苗 顧 曉 江 明**

1. 江蘇省靖江市人民醫院泌尿外科（靖江 214500）； 2. 江蘇省蘇北人民醫院泌尿外科；3. 南通大學醫學院基礎醫學研究室核受體與腫瘤研究實驗室； 4. 南通大學醫學院病理學系

·論 著·

人前列腺癌細胞系PC-3再表達雄激素受體（AR）的腫瘤生物學特性研究及其意義*

劉 欣1，2△曹靖晨3△王海燕3鄂 群3，4張 沖3張永輝3陳苗苗3顧 曉2**江 明3**

1. 江蘇省靖江市人民醫院泌尿外科（靖江 214500）； 2. 江蘇省蘇北人民醫院泌尿外科；3. 南通大學醫學院基礎醫學研究室核受體與腫瘤研究實驗室； 4. 南通大學醫學院病理學系

目的 研究人全長雄激素受體（androgen receptor， AR） cDNA質粒（pSAR-IRES-EGFP）在人進展期前列腺癌細胞系PC-3中穩轉染再表達，即人前列腺癌細胞系PC-3-AR+的腫瘤生物學特性及其干細胞相關基因蛋白表達的變化，探討AR的分子生物學作用。方法 （1）應用體外細胞培養，通過四氮甲基唑氮（MTT）和細胞劃痕等方法檢測癌細胞生長和遷移特性；Western Blot方法檢測干細胞相關蛋白的表達；細胞爬片和免疫熒光方法檢測干細胞相關蛋白的定位和表達。（2）應用人前列腺癌細胞組織重組-先天免疫缺陷小鼠（Nude）腎包膜下移植技術，建立人前列腺癌-小鼠移植瘤模型，通過H.E.染色和病理學分析研究癌細胞的成瘤性、浸潤和轉移能力等腫瘤生物學特性；通過免疫組化染色技術檢測移植瘤干細胞相關蛋白的定位和表達。結果 人雄激素非依賴型進展期前列腺癌細胞系PC-3再表達全長AR cDNA，即PC-3-AR+，導致以下情況的改變：（1）體外細胞培養中癌細胞的生長和擴增能力以及遷移特性均受抑制；（2）小鼠體內移植瘤腫瘤體積減小，癌細胞變大，分化增強，壞死增加和浸潤能力減低；（3）培養細胞中檢測到干細胞相關蛋白CD133、CD44和ALDH等的表達增加。結論 人雄激素非依賴型前列腺癌細胞系PC-3再表達全長AR cDNA，使其生長受抑，分化增強，壞死增加和干細胞相關基因蛋白（CD133、CD44和ALDH）的表達增加。

前列腺腫瘤； 細胞系， 腫瘤； 受體， 雄激素； 干細胞相關基因

前列腺癌（prostate cancer， PCa）是男性泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，其致死率在美國僅次于肺癌［1］。近年來，在中國前列腺癌的發病率逐年升高［2］。由于人群缺少前列腺特異性抗原（PSA）的篩查，中國初診前列腺癌患者在就診時病灶多已進展，甚至發生遠處轉移，因此，前列腺癌在中國人群中的發生、發展的分子機制和臨床早診早治的研究已引起人們的高度重視。

目前，前列腺癌的發病原因和發病機制尚不清楚，前列腺癌的發生與男性睪丸和雄激素（androgens）有著密切的關系。雄激素與核受體雄激素受體（androgen receptor，AR）結合，促使AR的反式激活，AR發生構相改變，形成二聚體與DNA上的雄激素反應元件（ARE）結合，后與共調節蛋白（共激活物或共抑制物）結合，作用于靶基因的增強子，促進靶基因的轉錄，引發一系列蛋白的表達，從而引起PSA表達增高，促進細胞增殖和抑制細胞凋亡等［3］。

近年來的研究發現，腫瘤內存在少數類似于干細胞的腫瘤細胞，稱為腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSC），這是一類具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能的細胞［4，5］。有研究指出，在極少量腫瘤干細胞高度擴增和分化能力作用下，即可復制原有腫瘤的異質性表型，使實體腫瘤進一步增大及轉移［6-8］。由于腫瘤干細胞具有自我更新及耐藥能力，被認為是腫瘤進展、轉移及腫瘤復發的重要因素，因此，傳統的腫瘤治療方案只能消滅大量的腫瘤細胞，而未能將CSC完全清除［7，9］。研究表明，前列腺癌細胞亦有向腫瘤干細胞轉化或逆分化的傾向，從而使癌細胞的惡性程度增高，進而向周圍組織臟器轉移［6］。前列腺組織正常干細胞和腫瘤干細胞表達不同程度的干細胞相關基因（stemness-related gene），如CD133、CD44和ALDH1等［10，11］，其可用于檢測前列腺癌干細胞的生物學特性的標記物。

本研究旨在應用體外細胞培養和體內人前列腺癌-小鼠移植瘤模型，研究人全長雄激素受體AR cDNA再表達人前列腺癌細胞PC-3-AR+與AR陰性PC-3細胞的腫瘤生物學特性的異同，從干細胞相關基因表達水平的變化，探討前列腺癌雄激素依賴性轉化的分子機制，為臨床預防和靶向治療雄激素非依賴性前列腺癌（androgen-independent prostate cancer，AIPC）提供前期實驗資料。

材料和方法

一、實驗材料

（一）細胞系

人進展期前列腺癌細胞系PC-3購自美國ATCC，該細胞系不具有可檢測的雄激素敏感性，為雄激素非依賴型細胞。人雄激素受體（AR）全長cDNA質粒（pSAR-IRES-EGFP）的構建和其穩轉染建立的AR再表達人前列腺癌細胞系PC-3-AR+ ，由美國John Hopkins大學醫學院John T. Isaacs教授贈送［12］。

（二）主要試劑

RPMI-1640培養基、0.25%胰酶消化液、雙抗，美國Hyclone公司；胎牛血清，美國Gibco公司；四氮甲基唑藍、DMSO，上海生工生物工程有限公司；蛋白裂解液、上樣緩沖液、脫脂奶粉，碧云天生物技術有限公司；AR抗體（sc-816）、CD44抗體（HCAM，sc-7297），美國Santa Cruz公司；CD133抗體（Anti-PROM1，SAB2107606）、β-actin抗體（A5316），美國Sigma-Aldrich公司；Anti-ALDH （ALDH1A1）抗體（611194），美國BD Transduction Laboratories公司；DAB顯色試劑盒，中杉金橋生物技術有限公司；ECL化學發光顯影劑，美國Thermo Pierce公司。

（三）小鼠

先天免疫缺陷BALB/C裸鼠，SPF級，8周齡，購自上海斯萊克動物公司。

二、儀器

CO2培養箱（美國Thermo Fisher），酶標儀（瑞士TECAN，M200），體視顯微鏡（德國Zeiss，Stemi DV4），倒置相差顯微鏡（德國Leica），正置熒光顯微鏡（德國Leica），電泳儀（美國Bio-Rad，PowerPac Basic），化學發光成像系統（美國Bio-Rad，ChemiDoc XRS+），小動物活體分子影像成像系統（美國UVP，iBox Explorer）。

三、實驗方法

（一）細胞培養

人進展期前列腺癌細胞系PC-3和PC-3-AR+用含5%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養液于37℃、5% CO2、飽和濕度恒溫培養箱培養，0.25%胰酶消化傳代。

（二）生長曲線實驗

PC-3-AR+（AR陽性）細胞和對照PC-3（AR陰性）細胞，經消化后計數，以4000/孔的密度接種至96孔板，每孔200μL，設5個復孔。各分兩組培養，一組用完全培養液，一組用雄激素濃度為1×10-6mol/L的培養液。培養1d，3d，5d，7d后加入5%四氮甲基唑藍（MTT）溶液20μL，繼續培養4h，后吸去上清，每孔加入DMSO溶液150μL，室溫搖床溶解10min，酶標儀檢測490nm處OD值。繪制生長曲線。

（三）細胞劃痕實驗

將PC-3-AR+細胞和PC-3細胞分別接種于6孔培養板，待細胞貼壁且融合后劃痕，用PBS洗掉漂浮細胞，加低血清培養基繼續培養，放入培養箱，按時取樣，拍照。觀察細胞向無細胞劃痕區遷移的情況。

（四）Western Blot

用蛋白裂解液（RIPA裂解液：PMSF=100：1）收集PC-3-AR+細胞和PC-3細胞蛋白樣品，為確保蛋白上樣量一致，經BCA蛋白定量法調整蛋白濃度為2μg/μL。在蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴5min。配制10%SDS-PAGE凝膠，按每孔50μg/25μL上樣，進行蛋白恒壓電泳，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓100V。電泳結束后，PVDF膜恒流轉膜，260mA，2h。取出PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2h。孵育一抗，4℃，過夜。洗膜后加入二抗（HRP標記）。ECL顯影劑顯影。

（五）細胞免疫熒光

將PC-3-AR+細胞和PC-3細胞分別接種于經多聚賴氨酸包被蓋玻片的24孔培育板內，細胞長滿至60%時，棄培養液，4%多聚甲醛固定30min，0.2%Triton X-100破膜5min，5% 小牛血清封閉 30min，一抗 4℃孵育過夜，熒光標記二抗室溫孵育2h， 每個步驟間均用0. 01 mol/L PBS 沖洗3遍。甘油封片后置倒置熒光顯微鏡下觀察。

（六）人前列腺癌細胞組織重組-移植小鼠模型

1. 組織重組塊的制備：將鼠尾提取的膠原蛋白（濃度為10 g/L）與工作液以2：1的比例混勻，置于冰上，加入相當數量GFP標記的前列腺癌細胞PC-3和PC-3-AR+，使最終每個組織重組塊含有2×105個細胞，吸取50μL膠原蛋白混合液滴加在無菌培養皿中，放于37℃培養箱中凝固30 min，待組織塊呈固狀后，加入少量RPMI-1640完全培養液，使培養液完全沒過組織塊，置于37℃和5% CO2培養箱中培養，備用。

2. 在無菌條件下，將組織重組塊接種于BALB/C裸鼠（Nude）的腎包膜下，縫合后，待老鼠完全蘇醒后置于屏障系統中飼養。

3. 小動物分子影像儀下觀察腫瘤狀況，記錄腫瘤大小。在8周和12周取帶有腫瘤組織的小鼠腎臟，浸泡于10%福爾馬林固定液中，留待做病理切片。

（七）病理切片和診斷

取帶有腫瘤組織的小鼠腎臟，置于10%福爾馬林固定液中浸泡固定24h，梯度酒精脫水透明，石蠟包埋，制備切片，常規HE染色，中性樹膠封片。光鏡下進行形態學觀察。

（八）免疫組織化學染色

取未HE染色的石蠟切片，脫蠟、水化，PBS沖洗，H2O2孵育5min，PBS沖洗，抗原修復，PBS沖洗，滴加山羊血清封閉10min，PBS沖洗，一抗4℃孵育過夜，PBS沖洗，二抗室溫孵育1h，PBS沖洗，DAB顯色，沖洗后蘇木素復染，鹽酸酒精分化，自來水沖洗，脫水、透明、封片。光鏡下觀察。

結 果

圖1 PC-3-AR細胞的鑒定AR為高表達，定位于細胞核

細胞培養中，我們發現PC-3-AR+細胞較PC-3細胞的黏附性更強，不易用胰蛋白酶消化傳代；應用MTT法檢測兩種細胞系增殖能力的差異（圖2），結果顯示，AR再表達人前列腺癌PC-3-AR+細胞相比于AR陰性（雄激素非依賴型）PC-3細胞，其增殖速度明顯減慢，生長擴增能力減弱，而且對雄激素有明顯反應。通過細胞劃痕法檢測兩種細胞系遷移能力的差異（圖3），結果顯示，AR的過表達，能抑制細胞遷移。

應用Western Blot方法，分別檢測PC-3-AR+和 PC-3細胞系中干細胞相關基因及CD133、CD44和ALDH1等表達情況（圖4）。AR在前列腺癌PC-3細胞中再表達，使得CD133、CD44和ALDH等干細胞相關基因蛋白的表達增高。

建立人前列腺癌細胞組織重組-移植先天免疫缺陷Nude小鼠模型（圖5），檢測轉染熒光蛋白GFP標記的PC-3-AR+的成瘤性及其腫瘤病理生物學特性，小鼠毛發呈非特異性背景色（圖6）。小動物分子影像系統圖片（圖6A）顯示，在手術8周后，PC-3細胞形成的腫瘤體積要明顯大于PC-3-AR+細胞。HE染色結果（圖6B）顯示，PC-3腫瘤組織中，癌細胞體積較小，核染色深，分化程度差，細胞排列紊亂，可見明顯癌細胞浸潤至Nude小鼠腎臟組織；而PC-3-AR+腫瘤組織，癌細胞體積較大，部分核呈空泡狀，可見明顯壞死區，癌細胞浸潤能力相對較差。

圖2 AR再表達對前列腺癌細胞增殖能力的影響A 未添加雄激素 B 添加雄激素

圖3 AR再表達對前列腺癌細胞遷移能力的影響

圖4 PC-3-AR 細胞干細胞相關基因蛋白CD133、CD44和ALDH1的表達

圖5 人前列腺癌細胞組織重組-移植Nude小鼠模型手術過程

移植瘤的免疫組化染色結果：細胞來源鑒定GFP和AR以及干細胞相關蛋白CD44的表達（圖7）。GFP在PC-3和PC-3-AR+移植瘤中均為只在瘤體部分陽性表達，AR在PC-3-AR+移植瘤中陽性表達，CD44在PC-3-AR+移植瘤中比在PC-3中表達增強。

圖6 雄激素受體再表達對人前列腺癌移植瘤的影響A： 用小動物分子影像儀拍攝的小鼠移植瘤模型， 腹部圖（小鼠毛發非特異性背景色）和腎臟移植瘤圖（手術后8周）； B： 腫瘤組織病理形態學觀察（左HE×50，右HE×200）

圖7 人前列腺癌細胞組織重組-移植瘤免疫組化結果

討 論

目前，前列腺癌的發病原因與發病機制尚不清楚，前列腺癌的高發人群集中在老年人，年齡越大發病率越高，青年人幾乎不發病，中年人發病少見。有研究發現，睪丸不發育或沒有睪丸的人不發生前列腺肥大，也不發生前列腺癌，說明前列腺癌的發生與男性睪丸和雄激素（androgens）有著密切的關系。雄激素是一類甾體類激素，在正常男性生殖系統的發育過程中起著關鍵性的作用。雄激素在血液中最主要的形式是睪酮，睪酮進入前列腺后，90%以上的睪酮轉化為雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT），DHT的親活力比睪酮大5倍。雄激素與核受體AR結合，促使AR的反式激活，AR發生構相改變，形成二聚體與DNA上的雄激素反應元件（ARE）結合，后與共調節蛋白（共激活物或共抑制物）結合，作用于靶基因的增強子、促進靶基因的轉錄，引發一系列蛋白的表達，從而引起PSA表達增高，促進細胞增殖和抑制細胞凋亡等［3］。目前，根據雄激素在前列腺癌發生發展中的特殊機制，去除雄激素或拮抗雄激素的內分泌治療已成為前列腺癌的重要治療手段之一。但一般經12～18個月的治療后，患者對內分泌治療的敏感性降低，即雄激素依賴性前列腺癌（androgen-dependent prostate cancer，ADPC）轉變為AIPC［13］，預后較差。Labrie等［14］報道稱去勢手術后，前列腺癌患者外周血睪酮含量降低了95%，然而前列腺組織中的DHT卻只降低了60%。Montgomery等［15-17］進而發現，AIPC患者腫瘤組織中的雄激素濃度是未進行去雄激素治療的前列腺癌組織中的3.8倍，與此同時，參與雄激素代謝的相關基因水平也明顯增加。結果表明，在去除雄激素治療的選擇性壓力下，前列腺癌組織能夠通過促進癌組織中局部雄激素生成這樣一種“逃逸機制”來對抗血液循環中雄激素的下降，但具體機制不詳。AIPC目前尚無有效的治療方案，因此，為阻止或延緩前列腺癌向失控性雄激素非依賴性發展，研究AIPC的發生機制，即雄激素依賴性向雄激素非依賴性轉變的分子機制，也就成為目前前列腺癌研究的熱點。

PC-3細胞為雄激素非依賴型人進展期前列腺癌細胞系，AR表達陰性，是對比性研究前列腺癌雄激素依賴性或非依賴性分子機制很好的模型［18］。有報道［12］PC-3-AR+細胞系為John T. Isaacs教授領導的實驗室應用人全長AR cDNA質粒轉染PC-3細胞而建立，AR表達為強陽性，應用雄激素誘導可部分恢復雄激素依賴性。我們應用PC-3-AR+和PC-3兩株細胞系，對比性研究AR對人前列腺癌細胞的腫瘤生物學特性和干細胞相關基因表達的影響。

在體外培養中我們發現，AR再表達對于人前列腺癌細胞的腫瘤生物學特性有明顯的改變，PC-3-AR+細胞較PC-3細胞的黏附性更強，難用胰酶消化下來，生長速度較慢。通過MTT和細胞劃痕實驗證明，AR再表達可以使得人前列腺癌細胞的生長能力減弱，細胞增殖和遷移受抑制。

繼之，我們建立了人前列腺癌細胞組織重組-移植小鼠模型，比較PC-3-AR+與PC-3細胞在體內移植瘤的腫瘤生物學特點的異同。PC-3細胞的成瘤率、成瘤體積均大于PC-3-AR+細胞，雖然兩株細胞系均未發見明顯轉移，但PC-3移植瘤癌細胞可向宿主Nude小鼠腎臟組織內明顯浸潤，且癌細胞體積較小，部分分化差，細胞排列紊亂，惡性程度較高。在兩株細胞的體內和體外實驗中，PC-3細胞都比PC-3-AR+細胞表現得更具有低分化癌細胞的特性，生長快，遷移能力強，體內惡性程度高。

我們的Western Blot結果顯示，PC-3中的干細胞相關基因 （包括CD44、CD133和ALDH）的表達均低于PC-3-AR+細胞。據報道，在PC-3細胞培養形成的全克隆和類干細胞球中沒有檢測到比母細胞PC-3更豐富的所謂腫瘤干細胞表面標記物［19］。雖然，CD133、CD44和ALDH1一直以來被作為腫瘤干細胞相關基因，但也有研究表明，CD44表達增高具有抗癌作用，CD44丟失可能有利于腫瘤侵襲［20］；應用磁珠分選得到的CD44+/CD133+亞型細胞的生長速率反而慢于PC-3細胞［21］；應用ChIP技術，發現在CD44和CD133基因的啟動子中存在AR結合位點（ARE），AR與CD44和CD133基因可能存在正向調節關系［20］。基于以上實驗結果，我們認為AR基因與正常和腫瘤干、祖細胞的分化程度、干細胞相關基因表達譜和細胞生物學特性之間的關系有待進一步研究。

我們將建立新的人前列腺癌體外和體內轉化醫學研究模型，應用先進的基因芯片和PCR芯片等高通量基因檢測技術，研究正常和腫瘤干、祖細胞及相互演變過程中干細胞相關基因表達譜的變化及其與細胞生物學和腫瘤生物學特性的關系，為臨床預防和有效治療AIPC提供理論基礎。

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（2015-05-28收稿）

Biological behaviors of human prostate cancer cells PC-3-AR+with androgen receptor （AR）-overexpressed and its signi cance

Liu Xin1，2△， Cao Jingchen3△， Wang Haiyang3， E Qun3，4，
Zhang Chong3， Zhang Yonghui3， Chen Miaomiao3， Gu Xiao2**， Jiang Ming3**
1. Department of Urology， Jingjiang People's Hospital， Jingjiang 214500， Jiangsu， China；2. Department of Urology， Subei People's Hospital of Jiangsu Province； 3. Laboratory of Nuclear Receptors and Cancer Research， Center for Basic Medical Research， Nantong University School of Medicine； 4. Department of Pathology， Nantong
University School of Medicine
Corresponding： Gu Xiao， E-mail： guxiao222@hotmail.com； Jiang Ming， E-mail： ming.jiang@ntu.edu.cn

Objective To investigate the changes of biological behaviors and stemness-related gene expression levels in human prostate cancer cells PC-3-AR+with androgen receptor （AR）-overexpressed and discuss its possible function.Methods （1） Cancer cell growth and migration were respectively measured by MTT assay and wound healing assay. The expressions of stemness-related proteins were detected by Western blot. The expression pattern and localization of stemness-related proteins were detected by cell immuno uerescence staining. （2） The human prostate cancer xenografting mouse models were established to detect the expression pattern and localization of stemness-related proteins and analyze histopathological changes. The models were established by implanting the tissue recombinants into the sub-renal capsule of severe combined immunode cient （Nude） mice. Results Overexpression of full-length androgen receptor （AR） in human prostate cancer cell line PC-3-AR+ could lead to the following results. （1） The characteristics of cell growth and migration were inhibited； （2） The differentiation ability of xenografted cancer cells was increased， the tumor size and invasion ability were decreased. （3） The expression levels of stemness-related proteins， such as CD133， CD44 and ALDH， were enhanced. Conclusion The overexpression of full-length AR cDNA in human prostate cancer cells may result in the changes of cancer biological behaviors and stemness-related proteins expression.

prostatic neoplasms； Cell Line， Tumor； receptors， androgen； stemness-related genes

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.07.002

R 737.25

資助： 本研究課題受國家自然科學基金（NSFC）面上項目（項目批準號：81372772）；

江蘇特聘教授科研基金（蘇教師【2012】34號）

**通訊作者， 顧曉， E-mail： guxiao222@hotmail.com； 江明， E-mail： ming.jiang@ntu.edu.cn

△為并列第一作者