洛伐他汀生物合成途徑中酰基轉移酶LovD的活性機制研究

于靖,曹緒芬,王佳旺,廉錚,趙晨

(1.河北省滄州市中心醫院 心血管內一科，河北 滄州 061000；2.河北省人民醫院 婦科，河北 石家莊 310014)

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洛伐他汀生物合成途徑中酰基轉移酶LovD的活性機制研究

于靖1,曹緒芬1,王佳旺1,廉錚1,趙晨2

(1.河北省滄州市中心醫院 心血管內一科，河北 滄州 061000；2.河北省人民醫院 婦科，河北 石家莊 310014)

目的 將突變前后的蛋白進行分子動力學模擬，從而探討酰基轉移酶LovD活性提高的原因。方法 對酰基轉移酶的平面結構進行擬合，通過底物通道NVR2.1計算軟件得到LovD的主要底物，在酶活性測定過程中計算均方根偏差(root mean square deviation，RMSD)和勢能、G0和G5的均方根波動(root mean square fluctuation,RMSF)數值、主要α螺旋區域I與通道周圍其他螺旋區域的距離等指標。結果 RMSD和勢能的計算結果表明，疊合后的蛋白結構組成并沒有發生較大的變換；G0和G5的RMSD數值比較表明，G0和G5整體的運動沒有發生較大的變化；G0和G5的RMSF數值比較表明，4個局部柔性峰值微弱變化區域和1個柔性變化較大的區域；通過底物通道計算軟件得到LovD主要的4條底物通道，α螺旋區域I是形成通道的核心螺旋區域；比較G0和G5的主要通道的寬度、長度、彎曲率等數值，突變后G5的主要通道變寬、變短、彎曲率變小；G5的距離變大。結論 遠距離的突變使得LovD活性提高是由于α螺旋I末端的柔性變化，導致α螺旋I的運動的變化，使得在α螺旋I附近底物通道變短、變寬、彎曲率減小。這些變化可能降低了底物進出主要通道的阻力，使得參與酶催化的底物在通過這些通道的時候的速率加快，從而使得催化效率提高。

酰基轉移酶；LovD；洛伐他汀；酶活性；動力學模擬

自然界中他汀類化合物有洛伐他汀和康帕克汀，洛伐他汀主要由真菌土曲霉(aspergillus terreus)模式菌株產生，而康帕克汀由橘青霉(penicillium citrinum)菌株產生。在洛伐他汀的生物合成途徑中，大部分的合成編碼基因都比較清楚，而基因LovD 編碼2-mehtylbutyryl/MJA(monacolin J acid，形成洛伐他汀的前體化合物)的轉移酶催化最后一步，使得從LovF 過來的酰基部分與加載到MJA 上C8的位置，最后生物合成為洛伐他汀[1]。在這一過程中，LovD 和LovF 的酰基載體區域(acyl carrier protein，ACP)的蛋白-蛋白的相互作用使得這一最后一步反應在土曲霉中高效進行[2]。傳統的他汀類化合物生產工藝是以洛伐他汀為原料，經化學合成得到。隨著現代生物學的發展，洛伐他汀的生物合成受到越來越多的重視，酰基轉移酶LovD是洛伐他汀的生物合成中一個重要酶，所以研究酰基轉移酶LovD活性對提高洛伐他汀的生物合成具有重要的意義,底物通道中G0和G5是影響活性的重要通道。本研究將突變前后的蛋白進行分子動力學模擬，從而探討酰基轉移酶LovD活性提高的原因。

1 材料與方法

1.1 材料 LovD突變前后的酰基轉移酶，購買于深圳市博谷網絡科技有限公司，批號為ZL110619。

1.2 方法 對酰基轉移酶的平面結構進行擬合，通過底物通道NVR2.1計算軟件得到LovD主要的底物，在酶活性測定過程中計算RMSD和勢能、G0和G5的RMSF數值(G0和G5通道中輸入蛋白質結構的數目為a、b 是通道的平均半徑[?]、c是通道的最大位置處的半徑[?]、d為 通道的平均長度[?]、e為通道平均彎曲率)、主要α螺旋區域I與通道周圍其他螺旋區域的距離等指標。

1.3 洛伐他汀的生物合成途徑，見圖1[3]。

圖1 洛伐他汀的生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis of lovastatin

2 結果

2.1 酰基轉移酶LovD 分子動力學計算 在蛋白質I末端區域柔性發生了明顯的變化：通過比較G0和G5的α原子均方根波動(root mean square fluctuation，RMSF)發現氨基酸區域的柔性變化位置并且柔性變化位置的氨基酸結構變化性較大。為了更加清楚RMSF變化區域所在的位置，將LovD主要α螺旋區域和β 折疊區域分別用大寫英文字母A～N標記顯示，如圖2，每一段區域分別用一個字母所代替[3]。

在β折疊區域K(1)、loop區域K-B(2)，β折疊區域L(3)，G0 的波動稍大于G5，在β折疊區域M(4)，G5的波動稍稍大于G0。而在α螺旋區域I 末端(5)有明顯的波動變化，并且G5 的波動小于G0 的波動。6個突變的位點并不在有波動的區域，引起這樣的結果可能是突變后，氨基酸殘基的之間的相互作用發生變化。見圖3。

圖2 LovD 主要α螺旋區域和β折疊區域的標記Fig.2 Main α-helix domain and LovD regional andβ folded tag

圖3 G0和G5的α碳原子均方根波動(上線：G0；下線：G5)Fig.3 RMS fluctuation of alpha carbon atoms in G0 and G5

通過以上結構的分析和比較，發現這6個位點的突變并沒有明顯改變整體的蛋白結構，但是，G5 的活性口袋張開幅度減小，即活性口袋變小，口袋變小可能導致底物與酶的結合能力發生變化，可能是影響酶催化活性變化的一個原因，本研究認為這不是主要的原因。因此，將分析的重點放在在蛋白質I區域末端，可以發現G5的均方根波動(RMSF)明顯降低，認為這個區域對LovD的酶催化活性有著很重要的影響，G5的活性提高與這個區域的氨基酸運動有很大關系。

G5 的柔性減小的區域I末端處在活性中心附近：通過前面的計算和分析發現，區域I末端對LovD有至關重要的影響，可能是引起催化活性變化的主要氨基酸位置，因此，為了更好地研究蛋白質區域I末端部分的氨基酸與底物的相互關系，本研究對原始晶體結構的底物蛋白相互作用進行分析。在α 螺旋區域I末端是一段loop區域，并且這段區域靠近活性中心，圖3顯示位于活性中心的底物MJA靠近柔性變化I末端區域。位于活性中心區域的氨基酸由于直接與底物發生相互作用，將直接影響酶催化的活性。

2.2 對LovD的底物通道的分析 LovD 突變后的主要通道的變化：為了進一步研究G0和G5的通道的特性，通過分析和比較G0和突變后G5主要通道的平均半徑、最大半徑、長度、彎曲率。表1顯示，G0和G5的通道，除了3c，其他3個主要通道的平均半徑(Avg_BR)與最大半徑(Max_BR)增大了，在表格中箭頭標示增大趨勢，表明小分子底物進入反應活性中心的阻力將減小；主要通道的長度(Avg_L)也變短，并且通道的彎曲率(Avg_C)也減小，在表格中箭頭標示下降趨勢，表明長度越短小分子底物將在通道中的時間縮短，而彎曲率的降低表明小分子底物進入活性中心的阻力也將降低。

表1 G0 和G5 的通道特性的比較Tab.1 Comparison of the characteristics of G0 and G5 channel

注：a大于等于0.9?通道的輸入蛋白質結構的數目、b通道的平均半徑[?]、c通道的最大位置處的半徑[?]、d通道的平均長度[?]、e通道平均彎曲率

從上面的分析可以看出，突變后的LovD(G5)主要通道變寬且變長，并且彎曲率也有所降低，由于這些通道特征值的改變，使得小分子在通過通道進入酶活性中心時與通道間的作用發生改變，小分子進入活性中心的阻力變小，小分子進入活性中心更加容易，這可能是G5產量提高的原因，而G0和G5的通道3c并沒有發生上述變化，很有可能是與其他3個底物通道相區別的底物通道，即通過3c通道的底物與通過通道1a、2b、4d的底物是不同的。因此，提出假設，對于LovD本研究認為底物MJA是首先進入到活性中心的，然后參與反應。因此，在排除其他因素的條件下，通過計算出來并根據通道理論得出的結論是，影響反應速率的關鍵是DMB-SMMP進入到活性中心的速率。

LovD主要是α螺旋區域的運動導致了通道的變化：為了更進一步分析主要通道變化的過程，分別計算了G0和G5的主要α螺旋區I和B、I和J域隨時間的距離變化，G0和G5I-B的距離的變化。G0的α螺旋區I和B的隨時間的變化與G5有微弱差別，但是，α螺旋區域I和J隨時間的變化有較大的差別，G5的α螺旋區I和J的距離比G0距離較大，而α螺旋區I和J是形成通道2b的主要螺旋區域，α螺旋區I和B是形成通道1a和4d(2條通道被一段loop區域隔開)的主要螺旋區域。因此，α螺旋區I、B和J區域是通道產生變化的直接原因。

3 討論

本研究結合蛋白質的通道理論進行分子動力學模擬來解釋酰基轉移酶LovD突變引起酶催化效率的改變。通常酶底物通過蛋白質的表面或者內部的通道進入活性心，對酶催化效率也起著至關重要的作用[4-7]。通過以上計算和分析，本研究對一個全新的突變引起催化效率改變的原因并作出了合理的解釋和闡明。首先，遠離酶活性中心的氨基酸突變導致酶活性變化的解釋本身是一個難點，其次，這樣的突變引起的變化也是一個復雜的變化[8-10]。本文通過動力學的方法結合蛋白質通道分析，發現這樣的突變結果并沒有引起酰基轉移酶LovD蛋白質結構和組成的變化，也并沒有引起蛋白質整體運動的變化[11]，但是，找到了遠離活性中心的多位點的氨基酸突變導致活性變化的一個原因：突變后的LovD的某一局部柔性發生較大的變化[12]，導致靠近這一區域的α螺旋區域的運動變化，使得以蛋白質α螺旋區域形成的主要通道的長度變短、平均半徑變大、彎曲率降低等[13-16]。因此提出假設：這些通道特性的變化，降低了底物進出主要通道的阻力，使得參與酰基轉移酶催化的底物在通過這些通道時的速率加快，使得催化效率提高。這一計算的研究發現，為解釋酶催化效率的提高提供了新的可能性，也將為酶催化設計提供可靠的指導依據。。

[1] Organization WH.World health statistics 2012[J].World Health Organization,2012.

[2] Hubert HB,Feinleib M,McNamara PM,et al.Obesity as an independent risk factor for cardiovascular disease:a 26-year follow-up of participants in the Framingham Heart Study[J].Circulation,1983,67(5):968-977.

[3] John LS, Karine A, Jonathan K, et al.Transformations of cyclic nonaketides by Aspergillus terreus mutants blocked for lovastatin biosynthesis at the IovA and IovC genes[J].Ore Blomol Chem, 2003，23(1):50-59.

[4] Pan W,Pintar T,Anton J,et al.Statins are associated with a reduced incidence of perioperative mortality after coronary artery bypass graft surgery[J].Circulation,2004,110(11 Suppl 1):45-49.

[5] Moosmann B,Behl C.Selenoprotein synthesis and side-effects of statins[J].The Lancet,2004,363(9412):892-894.

[6] Calderon RM,Cubeddu LX,Goldberg RB,et al.In Statins in the treatment of dyslipidemia in the presence of elevated liver aminotransferase levels:a therapeutic dilemma[J].Mayo Clinic Proceedings,2010,85(4):349-356.

[7] 李為民，孔一慧.他汀類藥物治療慢性心力衰竭的利弊探討[J].中華心血管病雜志，2006，34(9)：774-775.

[8] Manzoni M,Rollini M.Biosynthesis and biotechnological production of statins by filamentous fungi and application of these cholesterol-lowering drugs[J].Appl Microbiol Biotechnol 2002,58(5):555-564.

[9] Xie X,Pashkov I,Gao X,et al.Rational improvement of simvastatin synthase solubility in Escherichia coli leads to higher whole-cell biocatalytic activity[J].Biotechnol Bioeng,2009,102(1):20-28.

[10] Gao X,Xie X,Pashkov I,et al.Directed evolution and structural characterization of a simvastatin synthase[J].Chem Biol 2009,16(10):1064-1074.

[11] Xie X,Wong WW,Tang Y.Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH[J].Metab Eng 2007,9(4):379-386.

[12] Valera HR,Gomes J,Lakshmi S,et al.Lovastatin production by solid state fermentation using Aspergillus flavipes[J].Enzyme and Microbial Technology,2005,37(5):521-526.

[13] Loncaric C,Merriweather E,Walker KD.Profiling a Taxol pathway 10beta-acetyltransferase:assessment of the specificity and the production of baccatin III by in vivo acetylation in Ecoli[J].Chem Biol 2006,13(3):309-317.

[14] Wagner UG,Petersen EI,Schwab H,et al.EstB from Burkholderia gladioli:A novel esterase with a β‐lactamase fold reveals steric factors to discriminate between esterolytic and β‐lactam cleaving activity[J].Protein science,2002,11(3):467-478.

[15] Xie X,Meehan MJ,Xu W,et al.Acyltransferase mediated polyketide release from a fungal megasynthase[J].J Am Chem Soc,2009,131(24):8388-8389.

[16] Xie X,Tang Y.Efficient synthesis of simvastatin by use of whole-cell biocatalysis[J].Appl Environ Microbiol,2007,73(7):2054-2060.

(編校：王冬梅)

Catalytic activity mechanism study of acyltransferase LovD in biosynthesis of lovastatin

YU Jing1,CAO XU-fen1,WANG Jia-wang1,LIAN Zheng1,ZHAO Chen2

(1.Cardiovascular Internal Medicine, Cangzhou Central Hospital, Cangzhou 061000, China; 2.Department of Gynaecology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 310014,China)

ObjectiveTo explore the reasons for the increase of acyltransferase activity of LovD by molecular dynamics simulation of before and after mutation protein.MethodsThe planar structure of acylase were fitted, the main substrate LovD through the substrate channel NVR2.1 calculation, calculation of RMS deviations(root mean square deviation, RMSD) and potential energy in the determination of enzyme activity, root mean square fluctuation (RMSF) value of G0 and G5, mainlyα helical region I and channel around other helical region distance index.ResultsThe results showed that the calculation of RMSD and potential energy, consisting of protein structure after superposition which there were no great transformation; G0 and G5 RMSD numerical comparison showed that the whole movement of G0 and G5 had not changed; G0 and G5 RMSF numerical comparison showed that the 4 local flexible peak weak change in area and 1 flexible change in the larger region; LovD 4 major channels were calculated by substrate channel calculation software, αhelical region I was the core of helical region formed channel; comparison of G0 and G5 values of the main channel of width, length, bending rate, the main channel of the G5 mutation become wider, shorter, bending rate become smaller; G5 distance enlarged.ConclusionConclusion Distant mutation which increases the LovD activity is due to the flexible change α helical I end, lead to changes in motion αhelical I, makes the α helix I near the substrate channel becomes short and wide, bending rate decreasing. These changes may reduce main channel resistance in and out the substrate, that participate in enzyme catalyzed substrate to accelerate rate through these channels, thereby improving catalytic efficiency.

acyltransferase; LovD; lovastatin; enzyme activity; dynamics simulation

浙江衛生廳(2012KYB010)

于靖，男，碩士，主治醫師，研究方向：心血管內科方向，E-mail：yj12114@163.com。建議方法和結果也按照這個順序寫。

O64

A

1005-1678(2015)02-0096-04