甾體激素受體輔激活子-2對子宮內膜異位癥患者孕酮抵抗的作用研究

常玉華,劉香環,李坤

(1.山東省交通醫院 婦產科，山東 濟南 250031；2.山東省醫學科學院附屬醫院 婦產科，山東 濟南 250031)

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甾體激素受體輔激活子-2對子宮內膜異位癥患者孕酮抵抗的作用研究

常玉華1,劉香環1,李坤2

(1.山東省交通醫院 婦產科，山東 濟南 250031；2.山東省醫學科學院附屬醫院 婦產科，山東 濟南 250031)

目的 通過檢測子宮內膜異位癥(endometriosis，EMs)患者異位內膜和正常子宮內膜中孕酮受體(progesterone receptor，PR)和甾體激素受體輔激活子-2(steroid receptor coactivator-2，SRC-2)的表達，探討SRC-2對EMs患者孕酮抵抗的作用。方法 隨機選取2013年6月～2014年5月間在山東省交通醫院婦產科行腹腔鏡或開腹手術的EMs患者45例(異位內膜組)和35例因子宮肌瘤行子宮切除術患者非瘤區對照子宮內膜組織(對照內膜組)。采用反轉錄PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)和免疫組化檢測異位內膜組和對照內膜組中PR和SRC-2的表達，并進行比較。結果 PR和SRC-2在異位內膜組中的表達顯著低于對照內膜組(P<0.05)；對照內膜組中PR和SRC-2的表達在增生期增強，并隨著分泌期逐漸減弱，在整個月經周期中存在周期性變化，有統計學差異(P<0.05)；異位內膜組中PR和SRC-2的表達在增殖期和分泌期比較，無周期性變化，差異無統計學意義。結論 SRC-2可以調控PR基因的轉錄反應，促進靶基因的轉錄和蛋白表達，其表達下降可導致子宮內膜PR的表達改變，從而顯著消減子宮PR對孕酮的反應性。

子宮內膜異位癥；甾體激素受體輔激活子-2；孕酮受體；孕酮抵抗

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMs)是育齡期的婦女常見的多發病。據相關文獻報道，育齡期婦女患EMs的比例已經高達6%～10%[1]。而對于那些患有慢性盆腔痛或是不孕癥的育齡婦女，其患EMs的比例更是高達45%～50%[2]。異位內膜周期性出血形成的病灶會導致育齡期女性不孕及嚴重的慢性疼痛[3]。孕酮是拮抗雌二醇(estradiol，E2)的經典藥物，其可通過與受體結合介導信號傳導從而調控基因表達，抑制異位內膜的生長和炎性反應[4]。很多孕酮類藥物在臨床上用來緩解和控制EMs患者的癥狀。然而，雖然EMs患者的血清孕酮水平正常，但是其整個生殖系統對孕酮的反應性失調，表現為EMs患者對孕酮治療呈現低反應和無反應，這一現象被稱為“孕酮抵抗”[5]。目前國內外的研究表明，孕酮抵抗可能與甾體激素受體輔激活子(steroid receptor coactivator，SRC)等有關[6]。通常這些受體輔激活子蛋白以配體依賴性的形式與雌激素受體(ER)和孕酮受體(PR)結合，從而激活相關靶基因的轉錄和蛋白的表達[7]。近年來更多的研究表明[8]，SRC-2在調節PR功能上發揮著十分重要的作用。SRC-2是轉錄因子與順式作用元件(包括啟動子、增強子、調控序列和可誘導元件等，它們的作用是參與基因表達的調控)之間的“橋梁”蛋白，以多蛋白復合體的形式存在于細胞內，可以調控一系列基因的轉錄反應，并最終促進靶基因的轉錄和相關蛋白的表達[9-10]。為了進一步探討SRC-2對子宮內膜異位癥患者孕酮抵抗的作用，本課題隨機選取2013年6月～2014年5月間在山東省交通醫院行腹腔鏡或開腹手術的EMs患者45例和正常對照組35例，觀察ER、PR和SRC-2在EMs患者異位內膜組織和正常對照組在位內膜組織的表達情況，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取2013年6月～2014年5月間在本院行腹腔鏡或開腹手術的EMs患者45例(異位內膜組，EMs組)和35例因子宮肌瘤行子宮切除術患者非瘤區對照子宮內膜組織(對照內膜組)作為研究對象。年齡35～52歲，平均(43.53±9.55)歲。2組患者術前6個月內均未行激素或者抗子宮內膜異位癥的藥物治療，此外沒有內科合并癥，而且月經周期正常26～31 d。本實驗獲得患者知情同意，且得到本院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑和試劑盒 Trizol RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)；M-MuLV反轉錄酶(美國NEB公司)；5 U/μLTaq DNA聚合酶(廣州東盛生物科技有限公司)；兔抗人PR單克隆抗體(美國DAKO公司)，工作濃度1:100；兔抗人SRC-2單克隆抗體(美國DAKO公司)，工作濃度1:100；二抗為羊抗兔免疫球蛋白(上海通派生物科技有限公司)，工作濃度1:100。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集：樣本收集參考信聰伶等[11]方法。

1.3.2 RT-PCR擴增PR和SRC-2：引物由上海生工生物技術有限公司合成，序列為：PR上游：5’-AGCCGGTCCGCGTCC-AAG-3’下游：5’-CCACCCAGAGCCCGAGGG-3’SRC-2上游5’-GCTGGTGCTGGAGAAGGAGAAG-3’下游5’-GTGGAGGAACTCTG-GGAATGTG-3’。具體實驗操作按照RT-PCR試劑盒的說明進行，反應體系為50 μL，94 ℃下先預變性4 min，然后按照94 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 120 s，反復進行30個循環，最后在72 ℃下延伸10 min。

1.4 結果判斷

1.4.1 擴增產物的鑒定：取RT-PCR的產物10 μL，置于2%的瓊脂糖凝膠中電泳，相對分子質量標準采用pUC Mix Marker，以目的基因光密度與β-actin基因光密度的比值來確定。

1.4.2 免疫組化檢測結果判斷：選擇包含異位腺上皮和間質細胞的高倍鏡視野進行觀察，隨機計數60個腺上皮和間質細胞，然后按照著色程度和著色的百分比來評分。得分標準：弱表達為1分，中度表達為2分，強表達為3分，無表達為0分，半定量得分=Σ陽性細胞的染色強度×陽性細胞的百分數。

2 結果

2.1 2組子宮的內膜組織PR mRNA和SRC-2 mRNA表達比較 由圖1可知，子宮內膜異位組中PR和SRC-2的mRNA的表達顯著低于對照內膜組，差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖1 2組子宮內膜組織中PR和SRC-2mRNA比較*P<0.05，與對照組相比，Fig.1 Comparison of PR and SRC-2 mRNA expression of endometrial tissue between two groups*P<0.05，compared with control group

2.2 PR mRNA和SRC-2 mRNA在不同月經周期中的比較 如圖2所示，PR mRNA和SRC-2 mRNA在對照組中增殖期和分泌期表達的水平有顯著性差異(P<0.05)。而PR mRNA和SRC-2 mRNA在EMs組中增殖期和分泌期表達水平沒有統計學差異。

圖2 2組子宮內膜組織中PR和SRC-2 m RNA在不同月經周期中的比較*P<0.05，與增殖期相比Fig.2 Comparison of mRNA between PR and SRC-2 in different menstrual cycles of two groups*P<0.05， compared with proliferative phase

2.3 PR蛋白和SRC-2蛋白在子宮內膜組織中比較 由圖3可知，子宮內膜異位組中PR和SRC-2的細胞核內可見明顯的棕黃色染色現象，表達呈現強陽性；在對照組中呈現出較弱染色，表達呈現弱陽性。結果表明，子宮內膜異位組中PR和SRC-2的蛋白表達顯著低于對照內膜組，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 EMs組和對照組PR蛋白和SRC-2蛋白的表達比較Fig.3 Comparison of PR and SRC-2 protein expression between control group and EMs group

3 討論

近年來更多的研究表明[12]，SRC-2在調節PR功能上發揮著十分重要的作用。SRC-2是轉錄因子與順式作用元件(包括啟動子、增強子、調控序列和可誘導元件等，它們的作用是參與基因表達的調控)之間的“橋梁”蛋白，以多蛋白復合體的形式存在于細胞內，可以調控一系列基因的轉錄反應，并最終促進靶基因的轉錄和相關蛋白的表達[13-14]。當PR與孕酮結合后，其構型發生改變形成二聚體，該二聚體再通過有序的募集包括SRC家族在內的輔激活子來實現對靶基因轉錄的調節[15]。

SRC是最早發現的一類核受體輔激活子，包括SRC-1、SRC-2和SRC-3。其中SRC-2是子宮PR的優勢輔激活子，在子宮內膜和平滑肌細胞上的表達與PR具有時間和空間的一致性[16]。研究發現，SRC-2表達缺失可抑制PR介導的子宮內膜發生脫模樣變化。此外，PR正常的SRC-2基因敲除小鼠患有嚴重的生育功能缺陷。本研究也顯示，異位癥內膜組的PR和SRC-2的mRNA表達和蛋白表達均呈陰性，而對照組內膜的PR和SRC-2的mRNA和蛋白表達均呈陽性，而且2組的mRNA和蛋白表達量也不同，子官內膜異癥患者mRNA和蛋白表達均低于對照組。以上研究表明子官內膜異位癥患者存在PR的表達異常，而SRC-2是子宮PR的優勢輔激活子，SRC-2的表達下降會顯著消減子宮PR對孕酮的反應性。這可能就是子宮內膜異位癥患者孕酮抵抗現象的主要分子機制。

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(編校：譚玲)

Study on effect of steroid receptor coactivator-2 on progesterone resistance in patients with endometriosis

CHANG Yu-hua1,LIU Xiang-huan1,LI Kun2

(1.Department of Obstetrics and Gynecology, Traffic Hospital of Shandong Province, Jinan 250031, China; 2.Affiliated Hospital of Shandong Provincial Academy of Medical Science, Jinan 250031, China)

ObjectiveTo investigate effect of SRC-2 on progesterone resistance by detecting the expression of progesterone receptor and steroid receptor coactivator-2 in ectopic endometrium of patients with endometriosis and normal endometrium in control group.Methods45 cases of endometriosis patients admitted in department of obstetrics and gynecology of traffic hospital from June 2013 to May 2014 were selected as endometriosis group，and 35 cases ocontrol endometrial tissues in non-tumour region in patients with uterine fibroids who had a hysterectomy as control endometrium group.The expression of PR and SRC-2 in endometriosis and control group were detected by reverse transcription-PCR and immunohistochemistry.ResultsExpression of PR and SRC-2 in endometriosis group were significantly lower than control groups (P<0.05)；expression of PR and SRC-2 were enhanced in the proliferative phase and gradually weakened along with the secretory phase，existed cyclical variation in menstrual cycle,the difference had statistically significant (P<0.05)；expression of PR and SRC-2 had no periodic variation in the proliferative and secretory phase,the difference had no statistically significant.ConclusionSRC-2 could regulate transcription reaction of PR genes to promote transcription and protein expression of a target gene,its decreasing expression may lead to the changes of expression in the endometrium PR,PR significantly reduction of uterine progesterone reactivity.

endometriosis; steroid receptor coactivator-2; progesterone receptor; progesterone resistance

山東省自然科學基金(ZR2009CL027)；濟南市科技局科技明星計劃(20100118)；山東省醫學科學院醫學基金(201023)

常玉華，女，本科，主治醫師，研究方向：婦產科學，E-mail：qch1821460008@163.com。

R711

A

1005-1678(2015)02-0146-03