血栓通改善腦血管內皮細胞缺氧損傷的作用機制

徐春燕

四川廣元市精神衛生中心神經內科 廣元 628000

血栓通改善腦血管內皮細胞缺氧損傷的作用機制

徐春燕

四川廣元市精神衛生中心神經內科 廣元 628000

目的 探討血栓通在改善腦血管內皮細胞缺氧損傷的作用機制。方法 選擇在體外培養的人臍靜脈血管內皮細胞為研究對象，分為對照組（正常內皮細胞組）、血栓通組（血栓通＋正常內皮細胞組）、缺氧組（模擬缺氧內皮細胞）和缺氧血栓通組（血栓通＋模擬缺氧內皮細胞）。采用CCK－8試劑盒觀察各組內皮細胞的活性，通過流式細胞儀分析內皮細胞的凋亡情況。結果 與對照組比較，應用血栓通培育內皮細胞后，隨著時間的推移，內皮細胞活性呈明顯上升趨勢；而與血栓通組比較，缺氧組內皮細胞活性明顯下降；在血栓通干預后各個時間點的細胞活性逐漸增加，以24h效果最顯著。與常規缺氧對照組比較，缺氧血栓通組內皮細胞的凋亡率顯著降低，而缺氧誘導因子抑制HIF的表達后，缺氧內皮細胞的凋亡率顯著升高，最后在血栓通處理后，其內皮細胞的凋亡率顯著較血栓通未處理的缺氧誘導因子抑制組明顯降低。結論 血栓通可以明顯提高缺氧血管內皮細胞活性，當內皮細胞處于持續缺氧狀態時，還可以抑制內皮細胞的凋亡，具體的分子機制有待進一步研究。

血栓通；腦血管內皮細胞；缺氧損傷；作用機制

缺血性腦卒中是臨床上非常常見的一類疾病，最常見的有短暫性缺血發作、急慢性腦梗死等［1］。然而，在不同程度的缺血發病機制過程中，必然存在一定的缺氧［2］。臨床研究發現，缺氧誘導因子在缺血性腦血管病變中發揮保護作用，可以促使缺氧內皮細胞產生一種缺氧適應，一定程度抑制了疾病的進展［3］。血栓通是臨床上較為常見的一種治療缺血性腦血管病的中成藥制劑，臨床療效顯著，而對其具體作用機制的研究仍較少。我院研究了血栓通在改善腦血管內皮細胞單純缺氧損傷的作用機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）人臍靜脈血管內皮細胞購于上海拜力生物科技有限公司細胞庫。（2）主要試劑：血栓通超微粉由我院研制（100701），貯存液的配制：稱取一定量血栓通超微粉溶解于無血清DMEM培養基中，超聲波溶解1h，3 600r／min，離心10min，取上清液，過濾除菌，將剩余沉淀物于60℃條件下加熱烘干，計算血栓通實際溶解濃度，制備成2 000mg／L血栓通超微粉備用。

1.2 方法

1.2.1 分組：①對照組（正常內皮細胞組）：正常條件下進行培養；②血栓通組（血栓通＋正常內皮細胞組）：加入含通心絡超微粉（終濃度為100mg／L）聯合正常內皮細胞正常條件下進行培養；③缺氧組（模擬缺氧內皮細胞）：95%N2＋4%CO2＋1%O2條件下培養內皮細胞；④缺氧血栓通組（血栓通＋模擬缺氧內皮細胞）：加入含通心絡超微粉（終濃度為100mg／L）聯合95%N2＋4%CO2＋1%O2條件下培養的內皮細胞。

1.2.2 細胞活性的測定：操作嚴格CCK－8試劑盒說明書檢測試劑各組內皮細胞分別于缺氧0h、12h、24h、48h后測定細胞活性，通過流式細胞儀分析內皮細胞的凋亡情況。

1.3 統計學分析 采用SPSS 13.0進行數據統計，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組內皮細胞活性改變比較 與對照組比較，血栓組隨著時間的推移，內皮細胞活性呈明顯上升趨勢；與血栓通組比較，缺氧組內皮細胞活性明顯下降；在血栓通干預后各個時間點的細胞活性逐漸增加，以24h效果最顯著。見表1。

表1 各組內皮細胞活性改變情況比較 （±s）

表1 各組內皮細胞活性改變情況比較 （±s）

注：與對照組比較，＊P＜0.05；與缺氧組比較，＃P＜0.05；與對照組比較，＊＊P＜0.01

組別0h12h24h48h對照組1.101±0.046 8.201±0.432 8.299±0.465 8.899±0.547血栓通組1.097±0.043 8.983±0.451 10.012±0.511 12.013±0.997缺氧組1.100±0.045 6.245±0.409＊6.198±0.439＊5.224±0.325＊＊缺氧血栓通組1.098±0.047 7.778±0.460 8.301±0.558＃6.338±0.361

2.2 缺氧誘導因子對內皮細胞凋亡的影響 與常規缺氧對照組比較，缺氧血栓通組內皮細胞的凋亡率顯著降低，而缺氧誘導因子抑制HIF的表達后，缺氧內皮細胞的凋亡率顯著升高，在血栓通處理后，其內皮細胞的凋亡率較血栓通未處理的缺氧誘導因子抑制組明顯降低。見表2。

表2 缺氧誘導因子對內皮細胞凋亡的影響 （±s）

表2 缺氧誘導因子對內皮細胞凋亡的影響 （±s）

注：與常規缺氧組比較，＊P＜0.05；與缺氧誘導因子抑制組比較，＃P＜0.05；與常規缺氧組比較，＊＊P＜0.01，與缺氧誘導因子抑制組比較，＃＃P＜0.01

組別0h12h24h48h缺氧組1.035±0.061 13.552±1.632 21.997±1.876 31.9 44.729±2.973 99±2.671缺氧血栓通組1.029±0.055 8.001±0.523＊＊8.445±0.583＊＊15.446±1.042＊＊缺氧誘導因子抑制組1.033±0.057 21.003±1.980＊29.225±2.345＊＊46.571±3.004＊＊缺氧血栓通誘導因子抑制組1.032±0.056 14.329±1.231＃＃24.374±2.003＃

3 討論

血栓通在臨床上應用較廣泛，主要成分三七總皂苷，具有活血祛瘀、擴張血管、改善血液循環的作用，在臨床治療腦血管缺血性疾病方面有很好的臨床療效［4］。而有關血栓通在改善腦血管內皮細胞的作用機制相對甚少［5］。而腦血管缺血性疾病的具體發病機制不明，但許多相關研究表明持續缺血造成的缺氧在介導疾病進展方面發揮了重要作用。腦血管缺血缺氧性疾病患者中存在一種缺氧誘導因子［6－7］，其在細胞漿中穩定表達，而HIF－1α亞基在翻譯后即被泛素－蛋白酶水解復合體降解。因此，在正常氧飽和度下的細胞中基本檢測不到亞基的表達，而在缺氧狀態下，僅亞基的降解被抑制，1α和β亞基形成有活性的HIF－1，轉移到細胞核內調節多種基因的轉錄。它可以編碼促紅細胞生成素基因，血管內皮生長因子基因、胰島素樣生長因子Ⅱ基因、內皮素－1、血小板源性生長因子、葡萄糖載體蛋白1、3和糖酵解酶，包括醛縮酶A、烯醇化酶1、乳酸脫氫酶A、磷酸果糖激酶L、磷酸甘油酸激酶1、己糖基酶，2、3－磷酸甘油醛脫氫基因等，參與調解缺氧耐受反應［8－9］。

血栓通在治療腦血管缺血性疾病方面是否可以對缺氧機制產生一定的抑制作用引起了我們的重視，故我院開展了血栓通在改善腦血管內皮細胞缺氧損傷的作用機制探討，結果發現：（1）與對照組比較，應用血栓通培育內皮細胞后，隨著時間的推移，內皮細胞活性呈明顯上升趨勢；而與血栓通組比較，缺氧組內皮細胞活性明顯下降；在血栓通干預后各個時間點的細胞活性逐漸增加，以24h效果最顯著。血栓通可以明顯提高缺氧內皮細胞的活性，促進其缺氧耐受。（2）與常規缺氧對照組比較，缺氧血栓通組內皮細胞的凋亡率顯著降低，而缺氧誘導因子抑制HIF的表達后，缺氧內皮細胞的凋亡率顯著升高，最后在血栓通處理后，其內皮細胞的凋亡率顯著較血栓通未處理的缺氧誘導因子抑制組明顯降低。另外，血栓通可以明顯降低缺氧內皮細胞的凋亡，減少細胞快速壞死。這些作用機制可能與血栓通對于缺血誘導因子的調節有關，一方面上調缺血誘導因子；另一方面可能發揮了缺血誘導因子抑制內皮細胞凋亡［10］。

綜上所述，血栓通可以明顯提高缺氧血管內皮細胞活性，當內皮細胞處于持續缺氧狀態時，還可以抑制內皮細胞的凋亡，具體分子機制有待進一步研究。

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（收稿2014－12－18）

The mechanism exploration of how Xueshuantong improving the function of hypoxia－injured cerebral vascular endothelial cells

Xu Chunyan
Department of Neurology，the Guangyuan Psychiatric Health Center，Guangyuan62800，China

Xueshuantong；Cerebral vascular endothelial cells；Hypoxic injury；Mechanism

R743

A

1673－5110（2015）24－0014－03

【Abstract】Objective To explore the mechanism of how Xueshuantong improving the function of hypoxia－injured cerebral vascular endothelial cells.Methods The cultured human umbilical vein endothelial cells in vitro were selected as research subjects，which were divided into the control group（only including normal endothelial cells），Xueshuantong group（normal endothelial cells＋Xueshuantong），hypoxia group（simulated hypoxic endothelial cells）and hypoxia Xueshuantong group（Xueshuantong＋stimulated hypoxic endothelial cells）.The endothelial cell activity of all groups was observed using the kit uses CCK－8，and the condition of endothelial cell apoptosis was analyzed by flow cytometric method.Results Compared with the control group，as time went on，the activity of endothelial cells was gradually increased following the Xueshuantong application to the cultivation of endothelial cells.Hypoxia group decreased the activity of endothelial cells，which were advanced at each point after the Xueshuantong intervention and peaked at 24hours.Compared with hypoxia group，hypoxia Xueshuantong group had obviously lower apoptosis rate of endothelial cells，which was markedly elevated after the inhibitory expression of HIF by hypoxia－inducible factors，and was increased once again after Xueshuantong intervention finally.As noted，the apoptosis rate was significantly lower than that before Xueshuantong intervention.Conclusion Xueshuantong can significantly improve the activity of injured vascular endothelial cells induced by hypoxia，and can inhibit the cell apoptosis when under the state of continuous hypoxia.The specific molecular mechanism remains to be investigated further.