基于表面增強拉曼光譜的鴨肉中螺旋霉素殘留檢測

洪 茜,劉木華,袁海超,彭義杰,李 耀,趙進輝

(江西農業大學工學院生物光電及應用重點實驗室,江西南昌 330045)

基于表面增強拉曼光譜的鴨肉中螺旋霉素殘留檢測

洪 茜,劉木華,袁海超,彭義杰,李 耀,趙進輝*

(江西農業大學工學院生物光電及應用重點實驗室,江西南昌 330045)

利用表面增強拉曼光譜(SERS)法結合自適應迭代重加權懲罰最小二乘法(air-PLS)快速檢測鴨肉中的螺旋霉素殘留。首先采用OTR202作為SERS活性基底,確定了螺旋霉素的1 622 cm-1峰可以作為其在鴨肉提取液中殘留檢測的拉曼特征峰;然后,通過單因素分析法確定了實驗的最佳條件,并在該條件下建立了螺旋霉素濃度范圍介于4.0～50.0 mg/L之間的鴨肉提取液加標樣本的標準曲線,并獲得了良好的線性關系且線性回歸方程為y=26.681x+1233.5,決定系數R2=0.980 2,最低檢測限為4 mg/L,預測樣本的平均回收率為73.38%～105.25%。研究表明,采用SERS技術可以實現鴨肉中螺旋霉素殘留的快速檢測。

螺旋霉素;SERS;air-PLS;鴨肉

1 引 言

螺旋霉素(Spiramycin)是一種大環內酯類中譜抗生素,此類抗生素對革蘭氏陽性菌和支原體具有較強的抗菌活性,近年來不僅被廣泛地作為治療藥物使用,而且為了提高經濟效益已被普遍作為飼料添加劑以促進禽畜生長及預防疾病[1]。由于抗生素的濫用將直接危害人體的健康,因此其殘留問題已經引起了國內外的廣泛關注。目前常用于大環內酯類抗生素殘留檢測的傳統方法主要有高效液相色譜法[2-3]、液質聯用法[4-5]、微生物法[6]、酶聯免疫法[7]等。這些方法檢測精度高、靈敏度好,但是樣品前處理復雜、成本高,不利于實現大規模的現場檢測。

表面增強拉曼光譜(Surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)技術通過采用特殊制備的表面粗糙金屬或溶膠作為活性基底,將被測分子吸附到基底表面,從而使其拉曼信號大幅增強[8]。SERS因其在痕量物質檢測中有很大的優勢,近年來已經引起廣大研究學者的關注。袁鑫等[9]利用SERS技術建立了辣椒粉中的蘇丹紅Ⅰ號的快速定量檢測模型;李言等[10]應用SERS快速檢測赤蘚紅,并通過密度泛函理論計算了赤蘚紅的理論拉曼光譜,結果與實驗拉曼光譜具有很好的對應性;李春穎等[11]采用SERS結合化學計量學方法對水產品中的抗生素(氯霉素和磺胺甲基嘧啶)進行了痕量殘留檢測。但目前還沒有將SERS應用于鴨肉中螺旋霉素殘留檢測的報道。

本文對含有螺旋霉素的鴨肉提取液的SERS進行了分析,并且研究了樣品加入量和吸附時間對其SERS信號的影響,建立了含有螺旋霉素的鴨肉提取液的標準曲線以實現鴨肉中螺旋霉素的快速檢測。

2 實 驗

2.1 試劑與儀器

鴨肉(購于江西農業大學菜市場);螺旋霉素標準品(純度約為96.0%,購于中國物質標準網);OTR202、OTR103(購于歐普圖斯光學納米科技有限公司);乙酸乙酯(分析純);超純水。

RamTracer-200-HS型便攜式激光拉曼光譜儀(歐普圖斯光學納米科技有限公司);T10型實驗室超純水機(湖南科爾頓水務有限公司);JK-50B型超聲波清洗器(合肥金尼克機械有限公司); FA1004B型電子天平(精度為0.1 mg,上海上平儀器有限公司);VORTEX-5型漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器有限公司);JW-1024型低速離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司);T6系列紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器責任有限公司);石英比色皿;石英進樣瓶(北京成騰器材有限公司)。

2.2 樣品制備

鴨肉樣品前處理:向50 mL離心管中加入5 g攪碎的鴨肉和20 mL乙酸乙酯,漩渦振蕩2 min,超聲提取10min,4 500 r/min離心15min,取上清液。按上述步驟再重復提取1次,合并上清液, 4 500 r/min離心15 min,用快速濾紙過濾得實驗用鴨肉提取液。

鴨肉提取液加標樣本的配制:稱取10 mg螺旋霉素標準品,用鴨肉提取液定容于100 mL棕色容量瓶中,得到濃度為100 mg/L的鴨肉提取液加標儲備液。取不同體積的加標儲備液用鴨肉提取液稀釋至8個不同濃度的鴨肉提取液加標樣本溶液,其濃度范圍介于4.0～50.0 mg/L之間。

2.3 實驗方法

拉曼光譜儀采用785 nm激光波長、200 mW激光功率,光譜分析范圍為400～1 800 cm-1,分辨率為6 cm-1,積分時間為10 s,積分2次求平均。

分別改變待測樣品的加入量和吸附時間來優化實驗條件。在最佳實驗條件下,分別采集含有螺旋霉素的鴨肉提取液、螺旋霉素的標準品溶液和鴨肉提取液空白樣的SERS;在最佳實驗條件下,分別采集配制的8個鴨肉提取液加標溶液樣本的SERS。所有光譜采集5次。

將500μL的OTR202、20μL的待測液和100 μL的OTR103依次加入至石英進樣瓶中,均勻混合,再放至樣品池中采集拉曼光譜。

3 結果與討論

3.1 增強基底的紫外吸收光譜

金屬溶膠增強基底因制備簡單、增強效果及穩定性較好,已在表面增強領域中得到廣泛應用。目前,金溶膠和銀溶膠的研究較為普遍,雖然金的局域表面等離子體共振的能量與銀相比較低,但是金本身具有銀所不具備的優勢,即金的良好穩定性和生物相容性[12]。因此,本研究選用納米金溶膠OTR202作為增強基底。圖1中曲線(a)所示為納米金溶膠的紫外-可見吸收光譜,其最大吸收峰的位置約位于544 nm處,半峰寬約為56 nm。曲線(b)為增強基底OTR202和活化劑OTR103與螺旋霉素水溶液混合后的紫外-可見吸收光譜,其最大吸收峰的位置約處于552 nm處,相比于OTR202的最大吸收峰位置紅移了8 nm,并且半峰寬變大。這可能是由于螺旋霉素分子吸附在納米金顆粒表面之后,其表面等離子體共振性質發生變化,從而影響了納米金顆粒的尺寸大小或者聚集程度等因素[13]。

圖1 OTR202(a)和OTR202+螺旋霉素+OTR103(b)的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra of OTR202(a)and OTR202+spiramycin+OTR103(b)

3.2 鴨肉中螺旋霉素的SERS分析

圖2為鴨肉提取液、螺旋霉素水溶液和含有螺旋霉素的鴨肉提取液的SERS對比圖。由圖中曲線(a)可知,鴨肉提取液的主要SERS特征峰位于1 208,1 248,1 372,1 556 cm-1處。由曲線(b)可知,螺旋霉素水溶液的主要SERS特征峰位于1 234,1 372,1 556,1 622 cm-1處。而由曲線(c)可知,含有螺旋霉素的鴨肉提取液主要在1 208, 1 248,1 372,1 556,1 622 cm-1處出現了SERS特征峰。經對比不難發現,在含有螺旋霉素的鴨肉提取液的SERS特征峰中,1 208 cm-1和1 248 cm-1兩者為鴨肉提取液的SERS峰,而1 372 cm-1和1 556 cm-1兩個SERS特征峰在鴨肉提取液和螺旋霉素水溶液中均有體現,僅有位于1 622 cm-1處的SERS特征峰是螺旋霉素本身的SERS特征峰且未體現在鴨肉提取液中。因此,本研究將這個峰作為后續檢測螺旋霉素的主要SERS特征峰,這為實現鴨肉中螺旋霉素殘留的SERS分析提供了良好的依據。

圖2 鴨肉提取液(a)、螺旋霉素水溶液(b)與含有螺旋霉素的鴨肉提取液(c)的SERSFig.2 SERS of duck meat extract(a),spiramycin solution (b),and duckmeat extract containing spiramycin(c).

3.3 基于air-PLS的熒光背景扣除

為了更加直觀地對樣本的SERS信號進行對比與研究,本文采用自適應迭代懲罰最小二乘法(air-PLS)來實現拉曼光譜中的熒光背景扣除。近年來,air-PLS被提出用于校正拉曼光譜的基線漂移,它可全自動地進行光譜處理,不需要任何初始信息和人為干預,即能有效扣除原始光譜中的熒光背景[14-15]。圖3中曲線(a)為含有螺旋霉素濃度為15.0 mg/L的鴨肉提取液的原始拉曼光譜,曲線(b)為通過air-PLS擬合的熒光背景,曲線(c)為對曲線(a)進行熒光背景扣除后所得光譜。由圖3可知,該算法能在保留拉曼有用峰形的前提下有效扣除其中的熒光背景,減少熒光背景對光譜信息的影響。

圖3 air-PLS對熒光背景的扣除。(a)原光譜;(b)擬合熒光背景;(c)背景扣除后光譜。Fig.3 Fluorescence background subtraction by air-PLS.(a) Origin spectrum.(b)Fluorescence background fitted. (c)Spectrum after background subtraction.

3.4 樣品加入量對SERS信號的影響

研究發現,待測樣品的加入體積不同會對SERS信號的強度產生一定的影響。將OTR202和OTR103的加入量固定為500μL和100μL,圖4為含螺旋霉素濃度為15.0 mg/L的鴨肉提取液的加入量為15,20,25,30μL時的SERS信號的變化情況。通過對比發現,當樣品加入量由15 μL增加至30μL時,混合物溶液的SERS信號的1 622 cm-1峰呈現先增強后減弱的趨勢,并且當加入量為20μL時,該峰的強度值最大。此過程中該峰值增強可能是由于樣品加入量越大,待測分子的數目就越多;而減弱則可能是因樣品量的增加導致溶劑乙酸乙酯的量也在增加,從而影響了待測分子與納米金顆粒的吸附[16]。因此,本研究確定了待測樣品的最佳加入體積為20μL。

圖4 樣品加入量對SERS信號的影響。(a)15μL;(b) 20μL;(c)25μL;(d)30μL。Fig.4 Effect of the addition amount on SERS intensity.(a) 15μL.(b)20μL.(c)25μL.(d)30μL.

3.5 吸附時間對SERS信號的影響

實驗采集了同一濃度的待測樣品與基底的吸附時間分別為1,5,10,15,20 min時的SERS。由圖5可知,當吸附時間為1 min時,混合物溶液的SERS信號在特征峰1 622 cm-1處強度最大,隨后逐漸減弱。這可能是由于當納米金膠與待測樣品混合后會產生一定程度的聚集,從而產生決定SERS增強效果的活性熱點[14]。在本研究中,當金納米顆粒聚集1 min時產生的活性熱點能與待測樣品結合產生最佳的增強效果。因此,實驗確定最佳吸附等待時間為1 min。

圖5 吸附時間對SERS信號的影響。(a)1 min;(b)5 min;(c)10 min;(d)15 min;(e)20 min。Fig.5 Effectof adsorption time on SERS intensity.(a)1min. (b)5min.(c)10min.(d)15min.(e)20min.

3.6 標準曲線及預測結果

實驗采集了含螺旋霉素濃度分別為4.0,10.0, 22.0,35.0,50.0 mg/L的鴨肉提取液加標樣本的SERS,我們以這5個濃度作為橫坐標,以其SERS的1 622 cm-1處的特征峰強度作為縱坐標,繪制成如圖6所示的標準曲線。由圖可知,在含螺旋霉素的鴨肉提取液加標樣本的4.0～50.0 mg/L濃度范圍內,其濃度與SERS的1 622 cm-1峰強度呈現出良好的線性關系,其線性回歸方程和決定系數(R2)分別為y=26.681x+1233.5和0.980 2,并得到最低檢測限為4mg/L。應用得到的標準曲線對螺旋霉素濃度分別為20.0,30.0, 45.0 mg/L的鴨肉提取液加標樣本進行預測,結果如表1所示,其平均回收率的范圍為73.38%～105.25%。結果表明,利用SERS技術建立鴨肉中螺旋霉素殘留的快速檢測研究是可行的。

圖6 SERS信號(1 622 cm-1峰)強度與鴨肉中螺旋霉素濃度的標準曲線Fig.6 Standard curve between SERS(peak of1 622 cm-1) intensity and spiramycin concentration in duck meat

表1 預測結果分析(n=5)Table 1 Analysis of prediction results

4 結 論

運用SERS光譜法可以快速檢測鴨肉中螺旋霉素的殘留含量。實驗以OTR202作為表面增強活性基底,確定了1 622 cm-1峰可以作為鴨肉中螺旋霉素殘留檢測的SERS特征峰。采用air-PLS方法進行光譜數據預處理,通過單因素實驗分析法確定了當樣品加入量和吸附時間分別為20μL和1 min時采集的SERS信號最佳。最后在該條件下建立了鴨肉提取液中螺旋霉素殘留檢測的標準曲線,得到了在4.0～50.0mg/L濃度范圍內,其SERS的1 622 cm-1峰強度與螺旋霉素的濃度具有良好的線性關系,并且結果具有一定的可靠性。

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Detection of Spiram ycin Residue in Duck M eat Based on SERS

HONG Qian,LIU Mu-hua,YUAN Hai-chao,PENG Yi-jie,LIYao,ZHAO Jin-hui*
(Optics-Electrics Application ofBiomaterials Lab,College of Engineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)
*Corresponding Author,E-mail:zjhxiaocao@sina.com

The surface enhanced Raman spectroscopy(SERS)method combined with the adaptive iterative re-weighted penalized least squares(air-PLS)method was used for the rapid detection of spiramycin residue in duck meat.Firstly,the OTR202 was used as SERSactive substrate,and the peak 1 622 cm-1was considered as the Raman characteristic peak for spiramycin residue in duck meat extract.Then the optimum experimental conditions were determined by using the single factor experiment.Under these conditions,the duck meat extract spiked samples,in which spiramycin concentration range was 4.0-50.0 mg/L,were analyzed,and the standard curve was established and a good linear relationship was obtained.The linear regression equation was y=26.681x+1233.5, and the coefficient of determination(R2)was 0.980 2.The detection limit was 4 mg/L,and the average recovery rate was 73.38%～105.25%.The research results show that it is feasible to realize the rapid detection of spiramycin residue in duck meat by using SERS.

spiramycin;SERS;air-PLS;duck meat

洪茜(1991-),女,江西九江人,碩士研究生,2012年于江西農業大學獲得學士學位,主要從事熒光與拉曼光譜分析與檢測方面的研究。E-mail:hongqian1028@163.com

趙進輝(1978-),男,湖南華容人,博士,副教授,2008年于華南農業大學獲得博士學位,主要從事光譜分析與檢測方面的研究。E-mail:zjhxiaocao@sina.com

O657.37

A

10.3788/fgxb20153612.1464

1000-7032(2015)12-1464-05

2015-06-17;

2015-11-04

國家自然科學基金(31101295);江西省科技廳對外科技合作計劃(20132BDH80005);江西省科技廳科技支撐項目(2012BBG70058);江西省教育廳科技計劃(GJJ12244)資助項目