骨質疏松綿羊腰椎內不同椎弓根螺釘界面的組織學研究

劉達，康夏，謝慶云，張波，周江軍，王財儒，鄭偉，雷偉，潘顯明*

(1.成都軍區總醫院骨科，四川 成都 610083；2.南京軍區第184醫院骨科，江西 鷹潭 335000；3.第四軍醫大學西京醫院骨科，陜西 西安 710032)

實驗研究

骨質疏松綿羊腰椎內不同椎弓根螺釘界面的組織學研究

劉達1，康夏1，謝慶云1，張波1，周江軍2，王財儒1，鄭偉1，雷偉3，潘顯明1*

(1.成都軍區總醫院骨科，四川 成都 610083；2.南京軍區第184醫院骨科，江西 鷹潭 335000；3.第四軍醫大學西京醫院骨科，陜西 西安 710032)

目的 通過硬組織切片及染色技術觀察骨質疏松綿羊腰椎內膨脹式椎弓根螺釘(expansive pedicle screw，EPS)與骨水泥強化螺釘(polymethylmethacrylate-augmented pedicle screw，PMMA-PS)的釘道界面。方法 建立骨質疏松綿羊后將每只綿羊的腰椎(L1～6)隨機分入三個不同的置釘組。使用相同的方法制備釘道后，普通椎弓根螺釘(CPS)組：經椎弓根向椎體內擰入CPS；PMMA-PS組：向制備好的釘道內注入1.0 mL的PMMA后擰入CPS；EPS組：直接經椎弓根向椎體內擰入EPS。術后6周和12周處死綿羊，經硬組織切片及染色后行組織學觀察。結果 組織學觀察表明，在術后6周和12周，CPS組和EPS組中骨小梁直接與螺釘接觸，形成了“螺釘-骨質”界面。PMMA-PS組中PMMA包裹螺釘，阻礙了螺釘與骨小梁的直接接觸，形成了“螺釘-PMMA-骨質”界面，EPS組螺釘的前端明顯膨脹形成了一個“爪狀”結構，擠壓并顯著改善了局部的骨質條件。從術后6周到12周，CPS組和PMMA-PS組中螺釘周圍的骨質條件無明顯變化，PMMA無明顯降解吸收，PMMA組中形成了二次界面，然而，術后12周EPS前端周圍的骨質情況和釘道界面均明顯優于術后6周。結論 在骨質疏松綿羊腰椎內，術后早期EPS通過螺釘前段的膨脹擠壓刺激周圍骨小梁生長，顯著改善了周圍的骨質基礎，隨著螺釘膨脹部分持續擠壓的刺激，螺釘前段周圍的骨質條件在遠期有進一步的顯著改善，形成了良好的生物性界面，為螺釘的遠期穩定提供了良好的骨質條件。

骨質疏松椎體；膨脹式椎弓根螺釘；聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥；釘道界面；組織學觀察

目前，椎弓根螺釘系統已經成為脊柱外科的核心技術之一，并被廣泛的應用于臨床[1-3]。然而，骨質疏松嚴重影響螺釘的穩定性[4]，造成嚴重并發癥，甚至需要進行翻修手術。為有效提高骨質疏松條件下螺釘的穩定性，我們在前期設計出膨脹式椎弓根螺釘(expansive pedicle screw，EPS)，實驗發現EPS可以顯著提高脊柱螺釘的固定強度[5-8]，且不增加螺釘的長度和螺釘在椎弓根的直徑，可以有效的降低因改進螺釘設計帶來的諸多風險。

回顧大量文獻后發現：縱然聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)具有許多不足之處，但憑借其出色的力學強度和強化作用目前仍然被用于強化螺釘的穩定性[9-11]。而釘道界面情況是螺釘穩定固定的前提條件，特別是在體內，釘道界面的變化直接決定螺釘等內固定的動態穩定性及遠期穩定性。因此，對于椎弓根螺釘釘道界面的研究有助于深入了解螺釘在體內穩定的機制。

目前，EPS和傳統PMMA骨水泥強化螺釘(polymethylmethacrylate-augmented pedicle screw，PMMA-PS)誰具有更良好的界面呢？目前國內外的相關研究甚少。因此，本研究旨在通過硬組織切片及染色技術來觀察兩種不同椎弓根螺釘在骨質疏松綿羊腰椎中的釘道界面的組織學情況。

1 資料與方法

1.1 實驗材料及儀器 普通椎弓根螺釘(conventional pedicle screw，CPS)長度20.0 mm，直徑4.5 mm(見圖1a)。膨脹式椎弓根螺釘(expansive pedicle screw，EPS)長度20.0 mm，直徑4.5 mm，中央空腔直徑為1.0 mm。螺釘的前半段有一縱向裂隙，通過中央空腔將內栓插入螺釘后使螺釘的前段膨脹(圖1b～1c)。CPS 64枚，EPS(含配套內栓、壓棒和頂絲)32枚，所有螺釘均由醫用鈦合金制成，由山東樞法模-威高骨科醫療器械公司提供。PMMA骨水泥(天津合成材料工業研究所生產)用來強化螺釘。雙能X線吸收骨密度儀(Lunar Corp，Madison，WI，USA)由成都軍區總醫院內分泌科提供。eXplore Locus SP型Micro-CT(Healthcare，GE，USA)、輪轉式硬組織切片機(Leica-LA 2500，Germany)和全自動顯微鏡(Leica-LA，Germany)均由西京醫院全軍骨科研究所提供。

1.2 動物及模型建立 8只健康成年雌性綿羊，體重(55.7±5.6) kg，年齡(5.5±0.7) 歲，均已過生育哺乳期，由成都軍區總醫院實驗動物中心提供。所有涉及動物實驗的操作均嚴格遵守國家及成都軍區總醫院關于動物實驗的醫學倫理學規定。速眠新(0.1 mL/kg)，中國人民解放軍農牧大學軍事獸醫研究所研制)麻醉成功后，取俯臥位測量綿羊去勢前腰椎的骨密度(bone mineral density，BMD)。然后對所有綿羊行雙側卵巢切除術。術前半小時及術后肌注頭孢唑啉鈉1.0 g，2次/d，共3 d。術后1個月開始肌肉注射甲基強的松龍(0.45 mg/kg)，連續注射9個月后逐漸減量至停止(共10個月)，觀察1個月無不良反應后再次測量綿羊腰椎BMD。當綿羊腰椎BMD顯著下降，且下降>25%時確定骨質疏松動物脊柱模型建立成功[12]。

圖1 普通椎弓根螺釘(CPS)和膨脹式椎弓根螺釘(EPS)

1.3 實驗方法 麻醉成功后，綿羊取俯臥位，取腰部正中切口逐層切開，分離顯露L1～6的椎板及橫突。采用人字嵴頂點法確定進釘點，與棘突成40°角方向制備釘道，深度為20 mm，透視確定定位針位置良好。每只綿羊的腰椎(L1～6)隨機分入三個不同的置釘組，CPS組：經釘道向椎體內直接擰入CPS；PMMA-PS組：向釘道注入PMMA(1.0 mL)后再擰入CPS；EPS組：直接擰入EPS。置釘成功后依次縫合切口。圍手術期給予頭孢唑啉鈉預防感染。密切觀察術后動物生命體征、飲食、雙下肢活動及切口愈合情況。術后6周和12周分別隨機處死4只綿羊，取出帶有螺釘的腰椎，游離成單個椎體。每個腰椎隨機選擇一側椎弓根螺釘進行組織學觀察。

1.4 組織學觀察 用環鉆沿螺釘的長軸鉆取含螺釘的、直徑約1.5 cm的圓柱狀標本。將標本用10%中性甲醛固定5 d，不脫鈣，依次經70%、80%、90%、99%、100%的乙醇進行脫水(各18 h)，然后依次浸泡塑料液，包埋后固化成塊。使用輪轉式硬組織切片機，垂直于螺釘長軸的方向將螺釘的前端連同周圍骨組織連續切成厚度約30～50 μm的3張切片，對切片進行麗春紅-三色染色，使用全自動顯微鏡觀察釘道界面的情況。

2 結 果

2.1 大體觀察 麻醉清醒后綿羊可站立，術后第2天可自行行走。術后飲食、雙下肢活動及切口情況均未見明顯異常。術后2周，切口甲級愈合，給予拆線。術后未見任何脊髓、神經壓迫癥狀。

2.2 綿羊腰椎BMD 建模前后綿羊腰椎的BMD分別為(1.14±0.10) g/cm2和(0.83±0.07) g/cm2，建模后BMD下降平均為27.2%，差異具有統計學意義(P<0.05)，骨質疏松綿羊模型建立成功。

2.3 組織學觀察 CPS組中，骨小梁直接與螺釘表面接觸，釘骨之間形成了“螺釘-骨質”界面。術后6周，螺釘周圍的骨小梁數量較少，排列稀松，局部可見明顯的骨小梁斷裂，未見典型的髓腔結構(見圖2a～2b)。隨著時間的延長，術后12周螺釘周圍的骨質情況(骨小梁數量和密度)未見明顯變化(見圖2c～2 d)。

圖2 CPS組中釘道界面的組織學觀察

PMMA-PS組中，術后6周PMMA嚴密包裹螺釘，存在于釘骨之間及釘道周圍的骨髓腔內，阻礙了骨小梁與螺釘的直接接觸，釘骨之間形成了“螺釘-PMMA-骨質”界面(見圖3a～3b)。由于PMMA的存在，螺釘與骨小梁之間的界限模糊不清。隨著時間的延長，術后12周螺釘周圍的骨質情況未見明顯變化，PMMA未見任何降解、吸收跡象，仍然存在于釘道周圍的骨質中，釘骨之間形成了二次界面(見圖3c～3 d)。

EPS組中，術后6周螺釘的前段膨脹、擠壓周圍骨質，并刺激局部骨小梁生長，使螺釘前段周圍的骨質條件較CPS組有顯著改善(見圖4a～4b)。從術后6周到術后12周，螺釘的膨脹部分周圍的骨小梁數量明顯增加，新生骨不斷包繞螺釘并長入縫隙，成熟的骨組織完全取代了早期的纖維組織，骨小梁之間相互連接形成了典型的髓腔結構，進一步改善了局部的骨質情況(見圖4c～4 d)。釘骨之間形成了良好的“螺釘-骨質”界面。

圖3 PMMA-PS組中釘道界面的組織學觀察

圖4 CPS組中釘道界面的組織學觀察

3 討 論

為了避免因增加螺釘直徑和長度導致的諸多風險，我們前期研制出前段膨脹的椎弓根螺釘。通過體外生物力學實驗證實[5]，與USS，Tenor，CDH等普通螺釘相比，EPS可使穩定性提高48.4%、40.8%和25.3%。動物體內研究表明，EPS的前段膨脹，在體內形成了“釘中有骨，骨中有釘”的立體嵌合模式，較好的保證了螺釘在骨質疏松條件下的遠期穩定性[6]，在骨質疏松尸體腰椎中可以達到接近傳統的PMMA強化方法的穩定性[7]。PMMA因其良好的機械強度被廣泛的應用于螺釘的強化處理[9-11]。然而，螺釘的穩定性取決于釘道界面的強度，體內釘道界面的動態變化直接影響螺釘在體內的穩定性，目前國內尚無關于動物體內EPS與PMMA-PS釘道界面情況的比較研究。

傳統的X線和CT檢查可以清楚的顯示螺釘的位置及植骨融合等情況。然而，這兩種方法存在著很多的局限性，由于分辨率的原因，X線檢查不能準確的觀察釘道周圍的骨質情況及釘道界面情況，常常會受到諸多條件的影響；CT重建會因為螺釘的偽影而影響釘道界面的評價。更為重要的是，上述兩種方法均不能直觀的觀察螺釘周圍骨質的生長情況和釘道界面情況。因此，有必要使用更微觀、更直接、更清晰的方法來研究釘道界面的情況。

組織學觀察是采用不同的化學方法對標本進行染色，使組織被染上特定的顏色便于微觀結構的觀察。一般方法如下：將螺釘帶周圍骨組織制成特定形狀的標本，先用10%的中性福爾馬林或95%的酒精進行固定，再經一系列濃度梯度的乙醇進行脫水處理，然后進行塑料包埋，按照一定的方向將標本切成一定厚度的切片，使用不同的方法進行染色，最后可在顯微鏡下觀察釘道界面的情況。

Mutsuzaki等[13]將磷酸鈣涂層的螺釘置入日本大白兔的雙側脛骨近端，4周后取出螺釘帶周圍骨組織的標本，沿螺釘的縱向將標本切成厚度為30 μm的切片，使用蘇木精和伊紅(hematoxylin and eosin，HE)進行染色后發現：磷酸鈣涂層螺釘周圍的新生骨顯著多于普通螺釘，且新生骨組織與螺釘接觸良好，釘骨之間的接觸情況明顯優于普通螺釘，良好的釘骨界面為螺釘的穩定性提供了更為良好的骨質基礎。Hasegawa等[14]將羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)涂層的椎弓根螺釘置入骨質疏松比格犬的腰椎中，術后10 d取出標本進行切片，使用甲苯胺藍染色法后發現：HA涂層的椎弓根螺釘周圍可見新生骨組織與螺釘結合，釘骨之間接觸良好，而普通螺釘周圍僅與纖維組織結合。Xue等[15]擬通過阿倫膦酸鹽來改善長白豬體內椎弓根螺釘的穩定性，術后3月取出標本后采用亮綠染色法進行組織染色，觀察發現：經阿倫膦酸鹽治療后螺釘與周圍骨質的結合率顯著高于未治療組，結果表明阿倫膦酸鹽可促進周圍骨質與螺釘的直接接觸，顯著改善了體內釘骨界面的情況。本課題組[6]采用麗春紅-三色染色對早期設計的EPS在骨質疏松綿羊腰椎中的釘道界面情況進行觀察后發現，螺釘膨脹部分周圍的骨質不斷包裹并長入螺釘前段的縫隙中，形成了良好的釘道界面，同時形成了“釘中有骨，骨中有釘”的交叉嵌合模式。劉達等[16]使用硫酸鈣骨水泥來強化骨質疏松綿羊腰椎椎弓根螺釘的固定，術后3個月采用麗春紅-三色染色對標本進行染色，研究表明：術后3個月螺釘周圍的硫酸鈣完全降解吸收，螺釘周圍可見大量新生的骨小梁，與螺釘緊密結合，釘骨之間未見明顯縫隙，螺釘周圍的骨小梁數量及空間結構均明顯優于普通螺釘，形成了較好的“螺釘-骨質”界面。大量的研究證實組織學方法可以直接、清晰的反映螺釘周圍骨組織的生長情況及釘道界面的情況，目前已經被廣泛的應用于動物體內的實驗研究。

為了便于進行綿羊體內實驗研究，前期我們設計出用于固定綿羊腰椎的膨脹式椎弓根螺釘和普通椎弓根螺釘，并進行了綿羊腰椎體外研究[8]。通過硬組織切片及染色后進行了組織學觀察，結果表明：EPS螺釘的前段膨脹并擠壓周圍的骨質，提高了局部的骨質密度，在螺釘膨脹部分周圍可見斷裂的骨小梁，而骨小梁碎屑填充于螺釘前段的縫隙中。這可能是置釘過程中螺釘前段的縫隙對釘道周圍骨組織的刮擦而造成的。這些骨小梁碎屑填充在螺釘前端的縫隙中，可能會為新骨的生成、攀爬及骨小梁結構的重建提供良好的骨質環境。另外，在離體綿羊腰椎中形成了即刻的“螺釘-骨質”界面，為體內兩者的生物性結合和螺釘的遠期穩定性奠定了基礎。當然，體外實驗的這些推測還需要進一步的體內實驗來證實。

基于上述研究，本實驗進一步在骨質疏松綿羊腰椎中比較EPS和PMMA-PS的釘骨界面情況。研究發現，EPS前段膨脹的兩瓣擠壓并刺激周圍骨質生長，改善了螺釘前段周圍的骨小梁數量和空間結構，在術后兩個時間點上均明顯優于CPS前段周圍的骨質條件。同時，由于EPS前端的應力刺激持續存在，從術后6周到術后12周，螺釘前段周圍的骨小梁數量明顯增加，新生骨不斷包繞螺釘及長入縫隙，成熟的骨組織完全取代了早期的纖維組織，骨小梁之間相互連接形成了典型的髓腔結構，進一步改善了局部的骨質情況，釘骨之間形成了良好的生物性界面。術后遠期(12周)EPS前段周圍的骨質情況和釘骨界面均明顯優于近期(6周)。然而，CPS卻沒有這方面的優勢，隨著時間的延長，螺釘前段周圍的骨小梁數量和空間結構并沒有明顯的改善。

我們還發現，PMMA-PS組中PMMA嚴密包繞螺釘，存在于螺釘與骨組織之間。然而，隨著時間的延長，螺釘周圍的骨質條件未見明顯變化，未見PMMA降解、吸收的跡象。由于PMMA不降解，長期存在于螺釘與骨質之間，嚴重阻礙了螺釘與骨質的直接接觸，無法形成螺釘與骨質的生物性整合，在釘骨之間形成了二次界面——“螺釘-PMMA-骨質”界面，為螺釘的遠期穩定埋下了隱患。遺憾的是，本實驗并沒有觀察到PMMA-PS釘道周圍松動的跡象，可能與螺釘在體內放置時間過短及螺釘未成組安裝等因素有關。本研究僅采用硬組織切片及染色技術對釘道進行了組織學觀察，螺釘的穩定性還需要進一步的力學實驗來證實。

通過體內研究我們發現，在骨質疏松綿羊腰椎內，術后早期EPS通過螺釘前段的膨脹擠壓刺激周圍骨小梁生長，顯著改善了周圍的骨質基礎，隨著螺釘膨脹部分持續擠壓的刺激，螺釘前段周圍的骨質條件在遠期有進一步的顯著改善，形成了良好的生物性界面，為螺釘的遠期穩定提供了良好的骨質條件。

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Histological Comparison of Interfaces of Different Pedicle Screws in Osteoporotic sheep Lumbar Vertebrae

Liu Da，Kang Xia，Xie Qingyun，etal

(Department of Orthopaedics，Chengdu Military General Hospital，Chengdu 610083，China)

Objective To compare the interfaces of expansive pedicle screw(EPS)and polymethylmethacrylate-augmented pedicle screw(PMMA-PS)in osteoporotic sheep lumbar vertebrae through hard tissue sections and staining technique.Methods Six lumbar vertebrae(L1～6) in each sheep were divided into three groups randomly(two vertebrae with four pedicles in each group)after establishment of osteoporosis sheep.In CPS group，CPS was inserted through the pilot hole into vertebral body without any augmentation.In PMMA-PS group，PMMA(1.0 mL) was injected into the pilot hole prior to the insertion of CPS.In EPS group，EPS was inserted through pedicle into vertebral body.The sheep were sacrificed and lumbar vertebrae(L1～6) were harvested at the 6-week and 12-week post-operation，respectively.The histological observation was performed to evaluate the interfacial properties.Results It was clearly demonstrated in histological observations.The bone trabeculae wrapped up screw directly forming “screw-bone” interface in both CPS and EPS groups at both 6-week and 12 week post-operation.PMMA surrounding the screw hampered the direct contact between bone and screw and formed“screw-PMMA-bone”interface in PMMA-PS group.The anterior part of EPS presented an obvious expansion in vertebral body and formed a clawlike structure，which pressing the surrounding bone trabeculae and significantly improving the local bone condition(amount and density).From 6-week to 12-week post-operation，there was no visual difference in bone condition(amount and density)around screw in both CPS and PMMA-PS groups.PMMA was found remaining around screw without any degradation and absorption，which led to the second non-biological interface in PMMA-PS group.Nevertheless，bone condition(amount and density) around expanding part of EPS at 12 week were significantly improved compared with that at 6-week forming the good“screw-bone”interface.Conclusion EPS improve the bone condition around the anterior part of screw through expanding compression in early term in osteoporotic sheep lumbar vertebrae.Based on the stress stimulation from the continuous compression of anterior part of EPS，there is a significant improvement on the local bone condition in long term and form a good biological interface，which providing the good bone condition for the long-term stability.

osteoporotic vertebrae；expansive pedicle screw；polymethylmethacrylate bone cement；interface；histological observation

國家自然科學基金青年基金項目(81301606)，成都軍區總醫院院管課題資助項目(2013YG-B015)；

1008-5572(2015)01-0045-05

R318.01

A

2014-05-31

劉達(1982- )，男，主治醫師，成都軍區總醫院骨科，610083。

*本文通訊作者：潘顯明