高血壓性腦出血周圍腦組織超微結構及腦水腫發生機制研究*

劉永剛,姜 鳳,姜堯佳

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯154003)

高血壓性腦出血周圍腦組織超微結構及腦水腫發生機制研究*

劉永剛,姜 鳳,姜堯佳

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯154003)

目的: 高血壓性腦出血后周圍腦組織超微結構變化，基質金屬蛋白酶 2, 9(MMP-2, MMP-9) 表達在高血壓性腦出血后(早期)腦水腫發生中的作用。方法: 應用免疫組織化學方法檢測高血壓性腦出血患者出血后6h, 12h,24h,48h,72h,120h,1W,2W 血腫周圍腦組織中MMP-2、MMP-9 的表達，透射電鏡下觀察，血腫周圍腦組織超微結構變化。結果: 研究表明在高血壓性腦出血患者血腫周圍有腦水腫發生, 正常對照組中未發現明顯的 MMP-2, MMP-9 陽性表達, 而在高血壓性腦出血組出血24 h內MMP-2 及 MMP-9 則見明顯表達(P<0.01)。結論:MMP-2 及MMP-9 在腦出血患者血腫周圍腦組織的表達增高與高血壓性腦出血后腦水腫的發生具有密切的關系。

腦出血;腦水腫;超微結構;發生機制

腦出血后常見的繼發性損害是血腫周圍腦組織發生水腫,這可能與腦出血后，血腫周圍腦組織發生缺血、伴有炎癥反應等有關。而腦組織水腫可以使顱內壓增高，極易發生腦疝，導致患者死亡。其中MMP-2和MMP-9表達以及活性升高,降解細胞外基質，從而使血腦屏障(bloodbrainbarry,BBB)破壞,使腦微血管通透性及BBB通透性增加,造成出血周圍腦組織水腫以及神經細胞損傷。有研究表明,MMP-9在表達上的增多，是導致腦出血后腦水腫形成重要原因之一;而MMP-2在表達上的增多，可能在出血后早期腦水腫(24h內) 的形成起重要作用。故本研究選取高血壓性腦出血患者為研究對象,探討腦出血后腦組織中基質金屬蛋白酶2(matrixmetalloproteinase-2,MMp-2)及基質金屬蛋白酶9m(atrixmetalloporteinase-9,MMp-9)表達增高在腦水腫發生中所起作用,從而為患者的臨床治療提供更加切實可行的方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料

取30例佳木斯大學附屬第一醫院2011-06～2012～09高血壓性腦出血患者，急診行頭顱CT檢查，行開顱去骨瓣減壓術后，取血腫周圍腦組織作標本。男20例,女10例;年齡46～72歲。因無法從正常腦組織取材，以10例原發性癲癇病人手術切除癲癇灶處腦組織標本作為正常對照組。

1.2 方法

1.2.1 標本處理：病理切片的制作及主要試劑：取腦組織在10%福爾馬林中固定72h, 作冠狀切片, 厚約5mm，以石蠟包埋, 連續切片作MMP- 2、MMP- 9免疫組化染色。每張切片隨機選取不重復4個視野, 放到光學顯微鏡下(10×40倍)，計數MMP- 2陽性表達細胞數量、及MMP- 9陽性表達微血管數量, 算出平均MMP- 2陽性表達細胞數量、MMP- 9陽性表達微血管數量。MMP- 2、MMP- 9 免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2.2 采用干濕重法測定腦組織含水量：取材厚度3mm腦出血側腦組織測定濕重A, 然后在95℃烘箱中烘24h稱干重B,腦組織含水量的計算公式為：( 濕重A- 干重B) / 濕重A×100%, 數值精確到 0.1mg。

1.2.3 透射電鏡：取腦血管組織標本，剪成lmm×lmm×lmm大小，以戊二醛固定;然后用0.lPBS緩沖液漂洗15min，共4次;再以1%餓酸固定1.5h;用0.1mmol/LPBS緩沖液洗15min，共4次; 50%丙酮15min，1次;70%丙酮15min，1次;90%丙酮15min，1次;100%丙酮15min，共3次;純丙酮/樹脂l:1lh;純丙酮/樹脂1: 2 2h;純樹脂包埋過夜;修塊機修塊定位，然后經超薄切片機切片，將切片撈片置于銅網上;醋酸鈾及拘椽酸鉛染色,觀察結果。透射電鏡(JEM-1200EX,Japan)觀察。

1.3 統計學方法

采用單因素方差分析(one-way,ANONA) , 多個樣本均數之間的兩兩比較采用q檢驗。以均數±標準差表示MMP- 9 陽性微血管數與腦組織含水量之間采用直線相關分析。

2 結果

2.1 腦出血后水腫周圍組織含水量的變化情況

腦出血周圍腦組織含水量變化趨勢，在腦出血 12h明顯增加(P<0.05), 72h達到峰值(P<0.01), 2w與假手術對照組無明顯差別 (P>0.05)。見表1。腦出血后MMP-9 的表達與腦組織含水量之間密切相關。腦出血后MMP-9 陽性微血管數增高，腦組織含水量增加，二者的變化趨勢大體相同。

表 1 不同時間MMP-2,MMP-9表達陽性細胞數及腦組織含水量的變化±s)

2.2 光鏡(HE染色)

見圖1～4。

圖1MMP-9在對照組表達 ×200 圖2MMP-9在腦出血組表達×200 圖3MMP-2在對照組表達×200 圖4MMP-2在腦出血組表達×200

圖5 腦組織細胞腫大 圖6 胞漿呈空泡樣 圖7 細胞發生變性、壞死

2.3 透射電鏡

結果表明出血周圍腦組織血管內皮細胞腫大,伴有血腦屏障破壞,血管外紅細胞數明顯增多,血管周圍呈"空泡樣"。微血管管壁厚薄不均,內膜下層較不完整,內皮細胞間緊密連接受到破壞,中性粒細胞緊緊貼附于血管壁(圖5～7)。腦組織細胞腫大,胞漿呈空泡樣,部分細胞發生變性、壞死,細胞內細胞核固縮,細胞核核膜下染色質聚集一起。

3 討論

關于腦出血后腦水腫的研究比較關注于凝血酶的作用，以及應用凝血酶抑制劑的影響,細胞因子在水腫形成中的作用等實驗研究。而對于腦出血后腦水腫臨床性的試驗研究相對較少。本實驗對腦出血患者腦出血后24h內血腫周圍腦組織超微結構變化、MMP-2 與MMP-9 在不同時間的表達進行研究, 了解其在高血壓性腦出血后早期腦水腫中所起作用。我們發現在血腫周圍腦組織MMP- 9表達明顯增多, 發生在腦出血后6h，并且持續存在，在48h后達峰值, 而在2周后表達則明顯減少，幾乎為零。腦出血后MMP- 2表達顯著增多，出現在48h, 在出血120h達到峰值, 可持續較長時間。MMP- 2主要在巨噬細胞表達，Romanic等曾進行大腦中動脈局灶性腦缺血/再灌注的實驗，其實驗結果與我們是一致的的[1]。本實驗還顯示腦出血后MMP-9的表達增多，腦出血后腦組織含水量明顯增加，此二者時程上呈正相關。我們認為血腫邊緣內皮細胞對MMP-9的表達，可使腦出血后腦水腫加重，從而促使白細胞游出浸潤。研究表明內皮細胞能夠分泌MMP-9,通過釋放MMP-9,,從而降解基底膜, 破壞血腦屏障，使血腦屏障更易通透,導致血腫周圍的腦組織含水量明顯增加。在研究中我們發現中性粒細胞表達MMP-9, 發生在腦出血后 12～24h，24h后中性粒細胞以及巨噬細胞通過表達MMP- 9, 使其游出于血管外, 到達血管外腦組織后，釋放出血管活性胺，細胞因子等介質,導致腦組織發生繼發性損害,從而使腦水腫進一步加重[3，4]。Rosenberg[2]等用膠原酶法制作腦出血模型試驗表明,MMP- 9及腦組織含水量顯著增多, 發生于腦出血后24h，而通過MMP-9 抑制劑BB1101的使用, 可使腦組織含水量明顯減少, 但對于24h以后的腦水腫無明顯緩解, 說明MMP- 9 致出血周圍腦組織發生腦水腫，前期階段是由血腦屏障開放引起,后期階段則是由于巨噬細胞和中性粒細胞釋放血管活性胺，細胞因子等炎癥介質所引起的。所以我們在腦出血早期阻斷MMP- 9 的激活, 會減少腦出血后腦組織的水腫，從而避免顱內壓的增高，以及腦疝的發生。MMP-2 主要在巨噬細胞表達,在第5天達峰值, 而此時是腦組織損傷的修復階段[5]。我們發現血液中存在巨噬細胞，其能夠表達MMP- 2, 有利于巨噬細胞通過血管壁， 其可以吞噬細胞碎片以及壞死的機體組織, 起到修復損傷腦組織的作用。研究表明,MMP-2、MMP-9 在腦出血后腦水腫形成，腦組織損傷及損傷腦組織的修復具有重要的作用, 這將對于出血性腦血管病的預防及治療提供有利的支持。

[1]AMRomanic,RFWhite,AnthonyJ,etal.Matrixmetallopro-teinaseexpressionincreasesaftercerebralfocalischemiainrats.Inhibitionofmatrixmetalloproteinase- 9reducesinfarctsize[J].Stroke, 1998, 29: 1020-1030

[2]RosenbergGA,NavratilM.Metallopriteinaseinhibitionblocksedemainintracerebralhemorrhageintherats[J].Neurology,1997,48(4):921-926

[3]WeissSJ,PeppinGJ.Collagenolyticofthehumanneutrophil[J].BiochemPharmacol，1986, 35:3189-3197

[4]UnimoriEN,BouhanaKS,WerbZ.Vectoralerectionofextra-cellularmatrixproteins,matrix-degradingproteinasesandtissueinhibitorofmetalloproteinasesbyendothelialcells[J].JBiolChem,1990,265:445-451

[5]RosenbergGA,EstradaEY,DencoffE.Matrixmetallopro-teinasesandTIMPsareassociatedwithblood-brainbarrieropeningafterreperfusioninratbrain[J].Stroke, 1998, 29:2189-2195

黑龍江省衛生廳科研課題項目，編號：2011-380；佳木斯大學科學技術校級面上項目，編號：S2011-028。

劉永剛(1973～)男, 黑龍江綏濱人，碩士，副主任醫師。

姜堯佳(1976～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫師。E-mail:jyj761024@163.com。

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1008-0104(2015)02-0142-02

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