桂竹糖芥苷對大鼠腎髓袢升支粗段管周膜50 pS鉀通道活性的調控機制①

隋洪玉，齊淑芳，賈秀月，王 毅

(1.佳木斯大學生理教研室，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

桂竹糖芥苷對大鼠腎髓袢升支粗段管周膜50pS鉀通道活性的調控機制①

隋洪玉1，齊淑芳1，賈秀月1，王 毅2

(1.佳木斯大學生理教研室，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探討桂竹糖芥苷對腎髓袢升支粗段(thickascendinglimb,TAL)管周膜50pS鉀通道活性的調控機制。方法：采用細胞貼附式膜片鉗技術及免疫印跡技術測定桂竹糖芥苷對50pS鉀通道活性的調控機制。結果：桂竹糖芥苷可明顯抑制50pS鉀通道的活性(P<0.01)；PKC阻斷劑存在時，桂竹糖芥苷不再增加50pS鉀通道的活性(P>0.05)。結論：桂竹糖芥苷可能是通過激活PKC依賴途徑抑制50pS鉀通道活性的。

桂竹糖芥苷；髓袢升支粗段；鉀通道；PKC

桂竹糖芥主要分布在我國東北地區，為十字花科糖芥屬二年生草本植物，野生資源豐富，又名小花糖芥，其主要成分為糖芥強心苷(簡稱桂竹糖芥苷，erysimosides)，具有利尿、強心、抗心律失常等作用[1]。本實驗研究擬觀察桂竹糖芥苷對腎髓袢升支粗段管周膜50pS鉀通道活性的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

體重為70～90gSD大鼠，雌雄均可，購于哈爾濱醫科大學第二附屬醫院實驗動物中心。

1.2 藥品、試劑及藥材

CollagenaseA、actin、p-PKC、PKC(SantaCruz公司)；預染Marker(Fermentas公司)；ECL顯影液(Pierece公司)；桂竹糖芥(佳木斯市藥材中心)。

1.3 桂竹糖芥苷的提取

120g糖芥種子經80%乙醇回流提取4次，前兩次為2小時/次，后兩次為1小時/次，共得80mL合并濾液，在其中加入80mL正己烷萃取4次。過濾萃取液，得80mL液體，上10gMCI層析柱，然后分別用水和不同比例的甲醇(10%、20%、30%、40%、60%、80%、100%)洗脫分離[2]。并收集60%甲醇處的強心苷用于實驗[3]。

1.4TAL組織的制備

對實驗用SD大鼠進行頸關節脫位后，立即打開腹腔取出雙腎，剝除被膜，做薄的冠狀切片，而后將腎片置于含有膠原酶的溶液中，于37℃水浴鍋內孵育45～60min。在體視顯微鏡下，分離出腎髓袢升支粗段(TAL)并固定在載玻片上備用。

1.5 膜片鉗單通道記錄技術

用膜片鉗放大器記錄到50pS鉀通道電流后進行濾波及數字化處理，儲存并分析相關數據資料。通道活動度用NPo表示，為通道開放數與通道開放頻率的乘積，NPo=Σ(1t1+2t2+…… +iti)。

1.6 統計學方法

采用均數±標準差表示。實驗中各項指標均采用自身配對t檢驗，以P<0.05作為差異顯著性指標。

2 結果

2.1 桂竹糖芥苷對腎髓袢升支粗段管周膜50pS鉀通道活性的影響

桂竹糖芥苷(1μmol/L)可明顯抑制50pS鉀通道的活性，加藥前NPo為0.28±0.07，加藥后NPo為0.03±0.01，(n=3，P<0.01)。見圖1。

圖1 桂竹糖芥苷對腎髓袢升支粗段管周膜50pS鉀通道活性的影響

2.2PKC阻斷劑存在時，桂竹糖芥苷對大鼠髓袢升支粗段管周膜50pS鉀通道的影響

PKC阻斷劑(CalphostinC)存在時，桂竹糖芥苷不再抑制50pS鉀通道的活性，加藥前NPo為0.39±0.12，加藥后NPo為0.34±0.11，(n=3，P>0.05)。見圖2。

圖2CalphostinC存在時，桂竹糖芥苷對髓袢升支粗段管周膜50pS鉀通道的影響

3 討論

腎臟是機體最重要的排泄器官，在調節機體水鹽平衡及酸堿平衡中發揮重要作用，而腎髓袢升支粗段是腎小管的一部分，其生理功能主要表現在兩方面：一方面，它可以重吸收超濾液中20%～30%的Na+、Cl-、K+等物質，即具有重吸收功能；另一方面，通過對Na+和Cl-等物質的重吸收，使其成為腎髓質滲透梯度形成的重要部位，因而在尿液的濃縮和稀釋過程中發揮重要作用。大量研究發現，在髓袢升支粗段的管腔膜和管周膜上都存在著多種鉀通

道并發揮重要作用，其管周膜上鉀通道的主要作用是將細胞內K+轉運至組織間液，使細胞內K+濃度降低而促進K+的再循環，進而使管周膜超極化，加快Cl-的轉運，使細胞內Cl-濃度進一步降低，因此，可間接促進Na+-K+-2Cl-同向轉運體的轉運。利用膜片鉗單通道記錄技術發現，50pS鉀通道是TAL管周膜上的主要鉀通道，多種物質均可調節其活性，如ATP、花生四烯酸、腺苷、Ca2+等[4，5]。桂竹糖芥苷具有強心、利尿的作用，且發現其利尿作用可能與TAL管周膜50pS鉀通道活性有關[6]，但其對50pS鉀通道的調控機制尚不清楚。通過本實驗研究證實桂竹糖芥苷可明顯抑制50pS鉀通道的活性，且可能是通過激活PKC依賴途徑實現的。

[1]石秀梅，李孟全，高雪玲，等.桂竹糖芥中強心甙的種類及豐度研究[J]．牡丹江醫學院學報，2004，25(3)：39-40

[2]李孟全，王秋娟，關利新.桂竹糖芥苷對血管平滑肌細胞增殖的影響[J].中國天然藥物，2007，5(5)：370-373

[3]LeiZH,JinZX,MaYL,etal.CardiacglycosidesfromErysimumCheiranthoide[J].Phytochemistry, 1998, 49(6): 1801-1803

[4]隋洪玉，孫玉鴻，李瑩.腺苷類似物CHA對大鼠腎臟髓袢升支粗段中PKA及PLA2蛋白表達的影響[J].黑龍江醫藥科學，2011，34(4)：23-24

[5]HongyuS,HaiyanL,YujieL.InvolvementofproteinkinaseAactivationandphospholipaseA2inhibitionintheadenosine-activatedbasolateral50pSK+channelsinthethickascendinglimboftheratkidney[J].ActaPhysiologicaSinica, 2012, 64(4): 449-454

[6]隋洪玉，趙曉蓮，齊淑芳,等.桂竹糖芥苷.腎小管功能及髓袢升支粗段管周膜50pS鉀通道活性的影響[J].黑龍江醫藥科學，2013，36(3)：36-37

The regulatory mechanism of erysimosides on the basolateral 50 pS potassium channel in the thick ascending limb

SUIHong-yu1,QIShu-fang1,JIAXiu-yue1,WANGYi2

(1.Department of Physiology in the Jiamusi University,Jiamusi 154007,China;2．First Affiliated Hospital in the Jiamusi University, Jiamusi 154003, China)

Objective: To study the regulatory mechanism of erysimosides on the 50 pS potassium channel in the thick ascending limb (TAL) of rat kidney. Methods: The patch-clamp cell-attached recording technique was used to record the single potassium channel current. The western blot technique was used to detect the protein express of phosphate-PKC. Results: Erysimosides can decrease the 50 pS potassium channel activity of TAL, and PKC inhibitor can inhibit the effect. Conclusion: Erysimosides can inhibit the activity of basolateral 50 pS potassium channel by the PKC-dependent pathway.

erysimosides; thick ascending limb; potassium channels; protein kinase C

黑龍江省衛生廳科研項目，編號：2012-250；佳木斯大學青年基金資助課題，編號：Sq2012-36。

隋洪玉(1976～)女，黑龍江佳木斯人，博士，副教授。

王毅(1971～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副教授。E-mail:wangyijms@126.com。

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A

1008-0104(2015)02-0038-02

2014-01-06)