異丙酚預處理對擬阿爾茨海默病模型大鼠神經行為學和p38和caspase-3的影響①

鄧 萌，王景霞，張 巖，余立榮，鄧文偉

(1.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007；3.佳木斯大學口腔醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

異丙酚預處理對擬阿爾茨海默病模型大鼠神經行為學和p38和caspase-3的影響①

鄧 萌1，王景霞2，張 巖3，余立榮3，鄧文偉3

(1.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007；3.佳木斯大學口腔醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

異丙酚；阿爾茨海默病；大鼠；caspase-3

阿爾茨海默病(Alzheimerdisease,AD)是老年人中發病率高、危害性大的中樞神經系統退行性疾病，其確切病因和發病機制尚不完全清楚。異丙酚(propofol)為目前最為常用的靜脈全麻醉藥物,因其苯環上的結構與天然的抗氧化劑維生素E相似,因而具有一定的清除自由基和抑制脂質過氧化作用[1],一些在體動物實驗表明異丙酚具有腦保護效應[2～5]。本研究利用擬AD大鼠模型,觀察了用異丙酚預處理海馬組織中p38及caspase-3表達的影響,并結合行為學檢測,評價異丙酚的腦保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料

選擇大連醫科大學動物實驗中心提供清潔級Wistar大鼠50只；體重(225±25)g，隨機分為4組：青年組10只、假手術組12只、模型組14只、異丙酚組14只；標準喂養，自由飲水。除青年組大鼠外，其他各組按照60mg/kg體重腹腔連續注射D-半乳糖42d后，行手術。手術前檢測水迷宮，按照380mg·kg-1體重腹腔注射10%水合氯醛麻醉，然后將大鼠固定于腦立體定位儀上，前囟后3.8mm，中線右2mm，腦表面進針3mm，緩慢注射2min，假手術組注射生理鹽水2μL，Aβ對照組、異丙酚組大鼠注射2μL凝聚態Aβ1-40(10μg·μL-1)，留針10min，緩慢拔出，縫合切口，術后大鼠在低溫下蘇醒。15d后，行水迷宮檢測，然后斷頭處死，取腦組織備用。異丙酚預處理組大鼠于擬AD模型制作前30min,腹腔注射異丙酚100mg/kg,對照組、擬AD模型組用同樣方法腹腔注射生理鹽水。

1.2 大鼠行為學檢測

采用1984年提出的Morris水迷宮法用于評價空間學習記憶能力的指標。每天訓練5次，持續6天，在第7天后24h內進行空間探索實驗，記錄60s內大鼠跨越平臺相應位置的次數等，作為空間探索能力的指標。觀察記錄大鼠自入水到找到平臺所游路徑，所需要的時間(即逃避潛伏期)作為學習和記憶成績。本實驗中Morris水迷宮檢測分別在D-半乳糖注射42d、手術后15d后進行，其中Aβ注射后學習記憶成績下降30%以上的大鼠為AD造模成功。

1.3 標本采集和準備

大鼠于乙醚麻醉后，采用主動脈插管，生理鹽水灌洗后，再用10%多聚甲醛灌注約30min，至組織變白后，在前囟后4mm處腦組織行石蠟包埋，SABC法免疫組化染色檢測p38、caspase-3。

1.4p38、caspase-3表達的檢測

在光鏡下，p38、caspase-3陽性細胞為胞漿呈棕黃色。陽性細胞分布區隨機選取5個不重疊的高倍視野(×400)，在病理圖像分析儀下分別計數每個視野中的陽性細胞數，計算陽性細胞率(陽性率=陽性細胞數/(陽性細胞數+陰性細胞數)×100%)。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠造模前后及給藥后逃避潛伏期的測定

大鼠連續腹腔注射D-半乳糖42d后(手術前)，行注射Aβ后(手術后)，大鼠在定位航行中的逃避潛伏期(尋找平臺時間)檢測，見表1。

表1 大鼠逃避潛伏期的變化及異丙酚對其影響±s)

注：與手術前比較※P<0.05，※※P<0.01；與假手術組比較

△P<0.05，△△P<0.01；與Aβ對照組比較▲P<0.05；與青年組比較■P<0.01。

表2 AD模型大鼠跨越平臺次數及異丙酚對其影響±s)

2.2 大鼠經過平臺及有效區次數的檢測

AD模型制作前后大鼠在空間探索實驗中跨越

平臺及有效區次數測定結果，見表2。

假手術組、Aβ對照組、異丙酚組大鼠跨越平臺次數較青年組明顯減少(P<0.05)；模型制作后Aβ對照組和異丙酚組大鼠跨越平臺次數組間無顯著差異(P>0.05)，且均顯著少于手術前(P<0.01)，而且較假手術組均有顯著差異(P<0.01)；異丙酚組大鼠顯著增加平臺跨越次數，與Aβ對照組比較有顯著差異(P<0.05)。

2.3 海馬CA1區p38和caspase-3表達

見表3。

表3 各組海馬CA1區p38和caspase-3陽性細胞率

與青年組和假手術組相比，p38陽性細胞率明顯增多，有明顯的統計學差異(P<0.01)。異丙酚組與模型組相比，p38陽性細胞率下降，有明顯的統計學意義(P<0.01)。

3 討論

凋亡發生是一個復雜的由caspase家族成員介導的蛋白酶級聯反應過程[6]。在caspase家族中，caspase-3 是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路[7]。多種刺激因素啟動的信號激活caspase-3 使胞質、胞核及細胞骨架的主要蛋白質降解失活，caspase-3 在神經元凋亡中扮演著關鍵分子的角色，其在胞質激活，迅速轉移到胞核執行凋亡。Morris水迷宮是目前評價空間學習與記憶能力最廣泛使用的方法，主要檢測與海馬結構相關的記憶功能，對AD動物模型尤為適用[8]。本實驗顯示，與假手術組、異丙酚干預組相比，模型組上臺潛伏期延長，穿越原平臺次數下降，說明Aβ對大鼠的空間記憶獲取與保持能力具有損害，證明模型成功；異丙酚干預組與模型組比較，其上臺潛伏期明顯縮短，穿越原平臺次數有顯著的提升，提示異丙酚對于Aβ致AD大鼠的空間記憶獲取與保持能力有明顯的改善。本實驗顯示:模型組CA1區p38細胞陽性率增加，異丙酚組p38細胞陽性率降低。由此推測:Aβ1-40的沉積促進p38的活化，p38的活化可磷酸化tau蛋白、介導炎癥、凋亡反應及通過介導IL-1使突觸泡蛋白的合成減少，導致AD發生、發展。異丙酚可能通過抑制p38的活性，保護神經元、改善學習記憶能力。 本研究結果表明,擬AD模型建立前30min異丙酚預處理能改善擬AD模型大鼠學習記憶能力,降低p38和caspase-3的表達,可能通過抑制細胞凋亡而發揮腦保護作用。

[1]MurphyPG,MyersPS,DaviseMJ,etal.Theantioxidantpo-teotialofpropofol(2,6-diiosoproopylphenol) [J].BrJAnaesth, 1992,68(6):613-618

[2]楊靜,李天佐,張炳熙,等.異丙酚對谷氨酸誘導大鼠海馬神經元損傷的影響[J].中華麻醉學雜志,2005,25(12):917-918

[3]KodakaM,MoriT,TanakaK,etal.Depressiveeffectsofpropofolonapoptoticinjuryanddelayedneuronaldeathafterforebrainischemiaintherat-comparisonwithnitrousoxide-oxy-gen-isoflurane[J].Masui, 2000,49(2):130-138

[4]甘國勝,姜立,陳利民,等.異丙酚預處理對全腦缺血再灌注大鼠損傷和神經行為學的影響[J].中國臨床康復,2006,10(38): 79-81

[5]陳婷婷,王剛,周琪,等.異丙酚和異氟烷在瓣膜置換術中對腦保護作用的比較[J].中國體外循環雜志,2007,5(2):91-93

[6]AlbrechtS,BourdeauM,BennettD,etal.Activationofcaspase-6inagingandmildcognitiveimpairment[J].AmJPathol, 2007, 170(4):1200-1209

[7]RissmanRA,PoonWW,Blurton-JonesM,etal.Caspase-cleavageoftauisanearlyeventinAlzheimerdiseasetanglepathology[J].JClinInvest, 2004, 14(1):121-130

[8]朱秋雙，任春清，包利澤，等.何首烏對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力的作用[J].黑龍江醫藥科學,2011,34(3): 8-9

黑龍江省教育廳科研項目，編號：12541791。

鄧萌(1988～)男，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。

鄧文偉(1963～)男，黑龍江佳木斯人，學士，教授，碩士研究生導師。E-mail:dengww@163.com。

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