去乙酰化胃腸激素聯(lián)合G-CSF及bFGF促進糖尿病大鼠缺血后肢血管新生的研究①

張立海，王 嬌，陳福軍，鐘 敏，金 松，王桂梅，王亞洲，王躍生

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外一科，黑龍江 佳木斯 154003)

去乙酰化胃腸激素聯(lián)合G-CSF及bFGF促進糖尿病大鼠缺血后肢血管新生的研究①

張立海，王 嬌，陳福軍，鐘 敏，金 松，王桂梅，王亞洲，王躍生

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外一科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：研究去乙酰化胃腸激素(UAG)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)聯(lián)合堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)對糖尿病大鼠缺血后肢血管新生的促進作用及作用機制。方法：以120例Wistar大鼠為研究對象，隨機將其劃分為A、B、C三組，并將每組40例進一步劃分出組1、組2，各組1均為正常后肢缺血模型、組2均為糖尿病后肢缺血模型。A1、A2組不予藥物干預(yù)；B1、B2組予G-CSF聯(lián)合bFGF干預(yù)；C1、C2組予UAG、G-CSF聯(lián)合bFGF干預(yù)。術(shù)后1周，每組取10只大鼠，檢測缺血區(qū)組織基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達；術(shù)后4周，余大鼠行激光多普勒檢測后肢肌肉血流后，處死并檢測缺血區(qū)組織毛細血管數(shù)量。結(jié)果：MMP-9及VEGF表達均呈現(xiàn)C組>B組>A組、各組1>各組2趨勢，且C組與A組、B組與A組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時C2組MMP-9及VEGF表達均明顯高于B2組(P<0.05)；組內(nèi)對比，A1、B1組分別明顯高于A2、B2組(P<0.05)。肌肉血流及毛細血管數(shù)量亦呈現(xiàn)C組>B組>A組、各組1>各組2趨勢，且C1組與A1組，B1組與A1組，C2、B2、A2間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；組內(nèi)對比A1、B1組分別明顯高于A2、B2組(P<0.05)。結(jié)論：UAG聯(lián)合G-CSF與bFGF可有效促進糖尿病大鼠缺血后肢血管新生，其機制可能與促進MMP-9、VEGF的表達有關(guān)。

糖尿病；肢體缺血；血管新生；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；血管內(nèi)皮生長因子

WHO預(yù)測，2025年世界范圍內(nèi)糖尿病患者可能達到3億，將嚴重影響居民生活質(zhì)量[1]。糖尿病所致各種并發(fā)癥為其主要威脅，其中又以下肢缺血性病變較為常見，可進一步致死致殘，較具威脅。現(xiàn)階段對其的研究重點集中于促進血管新生，恢復(fù)下肢血流灌注，但糖尿病患者糖脂代謝紊亂、血管內(nèi)皮細胞功能受損，常規(guī)促血管新生藥物可能難以發(fā)揮作用[2]。G-CSF能夠刺激內(nèi)皮祖細胞的生長與分化[3]；局部應(yīng)用bFGF則有助于改善局部細胞生長環(huán)境，促進內(nèi)皮祖細胞向缺血組織趨化[4]；UAG有助于修復(fù)糖尿病患者EPC的活化缺陷。上述藥物聯(lián)用可能有助于缺血部位的血管新生，但尚需實驗探究，故我們開展本動物學(xué)研究，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

雄性Wistar大鼠120只，均購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，年齡10～12個月，體重250～280g；鏈脲菌素(上海巖生)、水合氯醛(上海巖生)、UAG(美國BioLegend)、bFGF(美國Sigma)、G-CSF(美國Sigma)、MMP-9酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢博士德)、VEGF酶聯(lián)免疫試劑盒(上海森林雄科)、CD34酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢博士德)等；石蠟切片機(武漢博士德)、激光多普勒超聲儀(瑞典百靈威)、酶標儀(美國BioTek)等。

1.2 方法

1.2.1 分組方法：所有大鼠按體重編號，行隨機數(shù)字表法多層分組。首先分為A、B、C三組，每組40只；隨后各組劃分出組1、組2，各20例。共得A1、A2、B1、B2、C1、C2六組。

1.2.2 造模方法：各組1均制備糖尿病模型：禁食12h，腹腔注射鏈脲菌素(60mg/kg，溶于我院自制檸檬酸緩沖液)。一周后采集尾靜脈血，空腹血糖超過300mg/dL說明造模成功。所有大鼠均制備后肢缺血模型：術(shù)前禁食12h、常規(guī)進水，戊巴比妥腹腔麻醉，仰臥固定于恒溫操作臺；右側(cè)腹股溝做切口，至膝關(guān)節(jié)，分離肌層；隨后暴露并分離股動脈，結(jié)扎、電灼，切除下段及分支。

1.2.3 用藥方法：待模型建立完畢后，間隔6h開始給藥，藥物劑量：UAG隔日1次，每次腹腔注射30μmol/kg；G-CSF首7日每日一次，皮下注射10μg/kg；bFGF首7日隔日1次，共4次，缺血區(qū)肌注5μg/kg。A組予等量生理鹽水，參考上述劑量注射；B組予G-CSF聯(lián)合bFGF，按照上述計量注射；C組在B組基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用UAG。

1.2.4 觀察項目：常規(guī)觀察大鼠體重、毛色、大小便、后肢運動情況等；模型建立1周后，各組取10只大鼠，處死，取缺血區(qū)肌肉組織2g，分兩份，分別用于檢測MMP-9及VEGF，均采取ELISA檢測法，操作步驟嚴格參照試劑說明書；模型建立4周后，行多普勒超聲檢測余大鼠下肢血流，隨后處死，取缺血區(qū)組織，固定、包埋、切片后行ELISA法檢測CD34陽性血管數(shù)，以評價大鼠微血管數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

P<0.05為差異具備統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MMP-9及VEGF表達對比

兩者表達一般趨勢均為：C組>B組>A組，且各組1>各組2。A、B、C三組間MMP-9水平行q檢驗指出B1、C1組均明顯高于A1組(q=4.31，4.33；P<0.05)，B2、C2均明顯高于A2組(q=3.82，4.58；P<0.05)，C2明顯高于B2(q=4.28；P<0.05)；A、B、C三組組內(nèi)對比，A1、B1分別明顯高于A2、B2組。其他項對比，未見明顯差異。VEGF表達統(tǒng)計學(xué)檢驗結(jié)果相同。見表1。

表1 大鼠MMP-9及VEGF表達對比

2.2 肌肉血流及微血管密度對比

兩指標一般趨勢亦為：C組>B組>A組，且各組1>各組2。A、B、C三組間肌肉血流PU值行q檢驗指出C1組、B1組均明顯高于A1組(q=4.05，4.97；P<0.05)，B2、C2均明顯高于A2組(q=3.47，3.99；P<0.05)，C2明顯高于B2(q=4.05；P<0.05)；A、B、C三組組內(nèi)對比，A1、B1均明顯高于A2、B2組。其他項對比，未見明顯差異。微血管密度統(tǒng)計學(xué)檢驗結(jié)果相同。見表2。

表2 肌肉血流及微血管密度對比±s)

3 討論

有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞移植有助于促進糖尿病大鼠后肢缺血血管的新生，這可能是因為移植的干細胞中富含內(nèi)皮祖細胞，其作為內(nèi)皮細胞的前體細胞，能夠迅速分化為血管內(nèi)皮，進而使血管新生[5，6]。本研究借鑒該結(jié)論，但試圖僅通過藥物注射達到相似的效果，對照組應(yīng)用的G-CSF，能夠提升循環(huán)系統(tǒng)中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量，該藥物為骨髓干細胞動員劑，早期研究證實其能夠作用于中性粒細胞系，刺激粒細胞及單核巨噬細胞成熟并向外周血釋放，近期亦有研究表明其能夠促進內(nèi)皮祖細胞增生，從而保證血管新生具有細胞基礎(chǔ)[7]；在此基礎(chǔ)上，對照組同時局部應(yīng)用bFGF，其為促有絲分裂因子[8]，亦能誘導(dǎo)形態(tài)發(fā)生和分化，能夠為內(nèi)皮祖細胞的生長提供物質(zhì)基礎(chǔ)，進而促進內(nèi)皮祖細胞向缺血區(qū)域趨化、歸巢，能夠提升靶向性，抑制其它組織的血管再生。本例中B組僅采用上述兩藥物聯(lián)用，對糖尿病及非糖尿病后肢缺血模型均有一定作用，但B組組內(nèi)對比，亦可表明，B1作用效果明顯優(yōu)于B2。這可能是由于糖尿病患者內(nèi)皮祖細胞及早期循環(huán)內(nèi)皮祖細胞動員受損所致。研究指出，內(nèi)皮祖細胞的動員與血管內(nèi)皮因子及MMP-9相關(guān)[9]，前者為血管內(nèi)皮細胞有絲分裂原，與受體結(jié)合后，能夠選擇性地促進血管內(nèi)皮祖細胞分裂增殖，為血管形成提供基質(zhì)；后者則有助于膜結(jié)合型配體向松散型配體轉(zhuǎn)化。本例A1、B1組中MMP-9及VEGF的表達均明顯高于A2、B2組，能夠直接證實糖尿病患者血管新生能力明顯降低，術(shù)后4周觀察肌肉血流及微血管數(shù)量，亦證實G-CSF聯(lián)合bFGF的療效尚需提升。

本研究結(jié)果同時能證實，在上述兩類藥物的基礎(chǔ)上，聯(lián)用UAG可能達到更佳的療效，C2組大鼠MMP-9及VEGF水平均明顯高于B2組，與之一致，其術(shù)后4周肌肉血流及微血管數(shù)量亦明顯高于B2組。這可能說明UAG有助于修復(fù)糖尿病患者EPC活化的缺陷。既往有研究指出該藥物能夠抑制p53及p21的表達與堆積[10]，后兩者均為調(diào)節(jié)細胞衰老的主要因子，大量堆積將導(dǎo)致內(nèi)皮祖細胞老化、血管再生能力下降。經(jīng)過輸注UAG后，C1、C2組MMP-9及VEGF的表達量大體一致，能夠說明大鼠內(nèi)皮祖細胞的增殖與動員能力已恢復(fù)至無糖尿病水平[11]；但C1組與B1組MMP-9與VEGF的表達基本一致，則提示在正常人群中，UAG可能無法繼續(xù)修復(fù)內(nèi)皮祖細胞活化的缺陷，因此可以認為，對UAG僅適用于糖尿病相關(guān)下肢缺血癥狀的治療，在其它下肢缺血癥狀中的療效及作用機制尚需進一步探究[12]。總之，本研究說明G-CSF聯(lián)合bFGF能夠?qū)崿F(xiàn)下肢缺血癥狀的血管再生，而對合并糖尿病患者，進一步聯(lián)用UAG能夠顯著提升療效。

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黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目，編號：12521551。

張立海(1979～)男，黑龍江樺南人，碩士，主治醫(yī)師。

王躍生(1960～)男，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：wys9906@163.com。

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1008-0104(2015)02-0019-02

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