依達拉奉減輕大鼠腎小管上皮細胞氧化應激與凋亡作用

張敏，沈建明

(1.湖北省醫學會，武漢 430071；2.湖北醫藥學院附屬人民醫院腎內科，十堰 442000)

依達拉奉減輕大鼠腎小管上皮細胞氧化應激與凋亡作用

張敏1，沈建明2

(1.湖北省醫學會，武漢 430071；2.湖北醫藥學院附屬人民醫院腎內科，十堰 442000)

目的 觀察依達拉奉對大鼠腎小管上皮細胞的保護作用及其機制。方法 將傳代培養的大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)分為對照組、模型對照組(50 μmol·mL-1順鉑)、給藥組A(50 μmol·mL-1順鉑+10 μmol·mL-1依達拉奉)、給藥組B(50 μmol·mL-1順鉑+20 μmol·mL-1依達拉奉)和給藥組C(50 μmol·mL-1順鉑+40 μmol·mL-1依達拉奉)，檢測各組細胞增殖能力、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、活性氧(ROS)水平、細胞凋亡率、Bax和Bcl-2蛋白和mRNA表達以及Caspase-3活性。結果 順鉑刺激NRK-52E細胞后，細胞增殖能力下降，MDA含量和ROS水平升高，SOD活性下降，細胞凋亡增加，Bax、Bcl-2蛋白和mRNA表達增多，Caspase-3活性升高。依達拉奉可以提高細胞增殖能力，降低MDA含量，降低ROS水平，增強SOD活性，減少細胞凋亡，下調Bax蛋白和 mRNA表達，上調Bcl-2 蛋白和mRNA表達，降低Caspase-3活性(P<0.05)。結論 依達拉奉通過減輕氧化應激和抑制細胞凋亡而減輕順鉑誘導的大鼠腎小管上皮細胞損傷。

依達拉奉；順鉑；損傷，腎；氧化應激；凋亡，細胞

順鉑是臨床常用化學治療(化療)藥物，由于其對癌細胞缺乏選擇性，而且進入機體后主要通過腎臟排泄，所以其腎毒性明顯。如何防治順鉑造成的腎損傷是亟待解決的問題。研究發現，在順鉑造成腎損傷的病理生理過程中，腎小管上皮細胞氧化應激和凋亡具有重要作用[1]。作為氧自由基清除藥，依達拉奉可以減輕急性腦梗死患者發生急性腎損傷的風險[2]。筆者在本研究中通過體外培養大鼠腎小管上皮細胞，在應用順鉑造成細胞損傷的同時予以依達拉奉干預，以觀察依達拉奉對順鉑誘導大鼠腎小管細胞損傷的影響并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 大鼠近端腎小管上皮細胞株(NRK-52E)購自廣州市齊云生物技術有限公司；依達拉奉(南京先聲東元制藥有限公司，批號：80-131111)，順鉑(浙江海正藥業股份有限公司，批號：20100123)，達爾伯克改良伊格爾培養液(Dulbecco's modification of Eagle's medium，DMEM，批號：11965-092)和胎牛血清(批號：120921)購自美國Gibco公司，丙二醛(malondialdehyde，MDA，批號：20121217)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，批號：20121215)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測熒光探針氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯[5-(and-b)-chloromethyl-2',7'-dichorodihydrofluorescein diacetate, acetylester,CM-H2DCFDA，批號：D12058]購自Molecular Probes公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(批號：20121013)購自南京凱基公司，兔抗大鼠Bax、Bcl-2單克隆抗體(批號：SC7780，BA1437)購自北京中山生物技術公司，RNA提取試劑Trizol(批號：1175563)購自Invitrogen公司，逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(批號：998697)購自杭州博日公司，PCR引物由上海英駿生物公司合成，Caspase-3活性試劑盒(批號：20120815)購自碧云天生物技術研究所。

1.2 細胞培養與分組 NRK-52E細胞用培養液于含5%二氧化碳(CO2)、37 ℃恒溫培養箱中孵育，0.25%胰蛋白酶消化，1：3傳代培養。待細胞融合達70%～80%時，改用無血清培養液培養24 h使其同步化。取對數生長期NRK-52E細胞分為5組：對照組、模型對照組(順鉑50 μmol·mL-1)、給藥組A(順鉑50 μmol·mL-1+依達拉奉10 μmol·mL-1)、給藥組B(順鉑50 μmol·mL-1+依達拉奉20 μmol·mL-1)、給藥組C(順鉑50 μmol·mL-1+依達拉奉40 μmol·mL-1)。每組均設5個復孔，順鉑和依達拉奉劑量參考文獻[3-4]。

1.3 檢測指標

1.3.1 細胞增殖能力檢測 按上述分組加入處理因素培養48 h，培養結束前4 h，培養板每孔加四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium salt，MTT，5 mg·mL-1)工作液20 μL，繼續培養4 h，終止培養，吸棄孔內培養液，加入二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)100 μL，振蕩混勻10 min。在酶標儀上檢測波長490 nm處各孔吸光度(A值)，各組細胞抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.3.2 細胞MDA含量和SOD活性檢測 按上述分組加入處理因素培養48 h，0.25%胰酶消化細胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗3次，加細胞裂解液100 μL裂解細胞，4 000 r·min-1離心，取上清液，Brad ford蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度，按試劑盒說明書操作，化學比色法測定細胞內MDA含量和SOD活性。

1.3.3 細胞內ROS水平檢測 按上述分組加入處理因素培養48 h后，滴加CM-H2DCFDA染液，37 ℃避光孵育30 min，吸除染液，PBS洗滌細胞3次，應用FLUOstar熒光定量儀檢測細胞內熒光強度，用以反映ROS水平。

1.3.4 細胞凋亡率的檢測 按上述分組加入處理因素培養48 h，取細胞1 mL(細胞密度1×109個·L-1)，800 r·min-1、4 ℃離心后，棄去上清液。預冷PBS漂洗，將細胞重懸于500 μL結合緩沖液中。加入AnnexinⅤ-FITC和PI各5 μL混勻，篩網過濾后，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.5 Western blot檢測Bax和Bcl-2蛋白表達 按上述分組加入處理因素培養48 h收集細胞，加細胞裂解液，破碎后樣品經低溫離心，取上清液測定蛋白含量，Western blot法檢測Bax和Bcl-2蛋白表達；β-actin內參，ECL化學發光，膠片顯影定影，Quatity One軟件進行灰度分析。

1.3.6 RT-PCR檢測細胞Bax和Bcl-2 mRNA表達檢測 按上述分組加入處理因素培養48 h后收集細胞。Trizol試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定其含量及純度。引物設計參照Premier 6.0設計，β-actin上游引物5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′，下游引物5′- AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′，擴增產物片段227 bp。Bax上游引物5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3′，下游引物5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′，擴增產物片段135 bp。Bcl-2上游引物5′-CCTGGCATC-TTCTCCTT-3′，下游引物5′-ACATCTCCCTGTTGACG-3′，擴增產物片段355 bp。退火溫度分別為58，55.1和49.7 ℃，30個循環。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠成像系統分析，計算目的基因與內參照基因A值的比值。

1.3.7 細胞Caspase-3活性檢測 上述分組加入處理因素培養48 h后收集細胞，加細胞裂解液，破碎后樣品經低溫離心，取上清液測定蛋白含量，與P硝基苯胺反應，比色法在波長405 nm處測A值表示Caspase-3活性。

2 結果

2.1 依達拉奉對NRK-52E細胞增殖能力的影響 模型對照組細胞生長抑制率(46.27±9.76)%。與模型對照組比較，給藥組A、給藥組B和給藥組C細胞生長抑制率[分別為(34.33±8.34)%，(23.88±5.73)%和(13.43±6.16)%]均降低(F=18.20，P<0.05)。

2.2 依達拉奉對NRK-52E細胞MDA含量和SOD活性的影響 對照組以蛋白質為單位的MDA含量為(6.24±1.33) nmol·mg-1，模型對照組MDA含量[(12.79±2.73) nmol·mg-1]較對照組高；給藥組A、給藥組B和給藥組C MDA含量[分別為(11.05±1.71)、(9.93±1.91)和(8.25±1.88)nmol·mg-1]均較模型對照組低(F=8.26，P<0.05)。對照組以蛋白質為單位的SOD活性(74.62±5.83)U·mg-1，模型對照組SOD活性[(43.52±6.94)U·mg-1]較對照組低；給藥組A、給藥組B和給藥組C SOD活性[分別為(52.38±7.75)，(60.26±6.74)、(65.67±7.32)U·mg-1]均較模型對照組高(P<0.05)。

2.3 依達拉奉對NRK-52E細胞ROS水平的影響 對照組熒光強度為(3.1±0.6)，模型對照組熒光強度(13.6±2.1)較對照組升高，給藥組A、給藥組B和給藥組C的熒光強度[分別為(11.5±2.0)，(8.9±1.8)，(7.1±1.5)]均較模型對照組低(P<0.05)。

2.4 依達拉奉對NRK-52E細胞凋亡的影響 對照組細胞凋亡率(6.33±0.38)%，模型對照組細胞凋亡率[(38.41±1.59)%]較對照組高，給藥組A、給藥組B和給藥組C細胞凋亡率[分別為(32.17±1.65)%，(27.63±1.56)%和(21.58±1.32)%]均較模型對照組降低(P<0.05)(圖1)。

2.5 依達拉奉對NRK-52E細胞Bax和Bcl-2蛋白和mRNA表達的影響 對照組Bax蛋白和mRNA的表達分別為 0.21±0.04，0.46±0.05；模型對照組Bax蛋白(0.89±0.23)和mRNA(1.96±0.56)表達均較對照組增加；給藥組A、給藥組B和給藥組C的Bax蛋白[分別為(0.77±0.10)，(0.53±0.08)，(0.43±0.07)]和mRNA[分別為(1.70±0.33)，(1.46±0.24)，(0.89±0.13)]表達均較模型對照組低(F=23.71，18.99，P<0.05)；對照組Bcl-2蛋白和mRNA的表達分別為(0.29±0.08)，(0.54±0.03)，模型對照組Bcl-2蛋白(0.39±0.09)和mRNA(0.70±0.09)均較對照組增加；給藥組A、給藥組B和給藥組C的Bcl-2蛋白[分別為(0.52±0.11)，(0.63±0.12)，(0.74±0.17)]和mRNA[分別為(0.89±0.15)，(1.22±0.17)，(1.48±0.29)]均較模型對照組高(F=15.57，23.52，P<0.05)(圖2，圖3)。

2.6 依達拉奉對NRK-52E細胞Caspase-3活性的影響 對照組Caspase-3活性為(0.07±0.03)，模型對照組Caspase-3活性(0.51±0.11)較對照組高，給藥組A、給藥組B和給藥組C的Caspase-3活性[分別為(0.40±0.09)，(0.32±0.08)和(0.24±0.07)]均較模型對照組低(P<0.05)。

3 討論

順鉑是一種鉑類抗癌藥物，對部分腫瘤有較好療效[5]。但在臨床應用過程中發現，因順鉑化療而導致腎損害的發生率高達20%～30%[6]，順鉑對腎臟的損傷主要表現在腎小管損傷。與QI等[3]報道相似，本研究將大鼠NRK-52E細胞和順鉑一同培養48 h，發現NRK-52E細胞增殖能力降低，也說明順鉑可以引起腎小管上皮細胞損傷。

病理情況下，順鉑可以損害線粒體呼吸鏈的正常電子傳遞，導致ROS生成過多，進而引起更加劇烈的氧化應激反應，加重細胞損傷。國外研究顯示，在順鉑腎損傷大鼠模型中，腎組織SOD活性降低，MDA含量升高[7]，將順鉑和豬腎小管上皮細胞一起培養，細胞ROS水平明顯升高[8]。本研究也發現，順鉑可以引起大鼠NRK-52E細胞MDA含量升高，SOD活性下降，ROS水平升高，進一步說明氧化應激參與順鉑誘導腎小管上皮細胞損傷。研究顯示，順鉑可以引起人腎小管上皮細胞Bax/Bcl-2比值和Caspase-3活性升高，細胞凋亡顯著[9]。本研究也發現順鉑引起NRK-52E細胞凋亡增多，Bax和Bcl-2蛋白和mRNA表達增加，caspase-3活性增強。

依達拉奉是目前常用于治療腦梗死的自由基清除藥[10]，在過氧化氫誘導的海馬神經元HT22細胞損傷模型里，依達拉奉可以具有拮抗氧化應激、降低ROS水平、下調Bax表達、上調Bcl表達、抑制細胞凋亡、減輕細胞損傷的作用[11]。本研究給予依達拉奉干預后，大鼠NRK-52E細胞增殖能力升高，說明依達拉奉可以減輕順鉑造成的腎小管上皮細胞損傷。同時給藥組腎小管上皮細胞MDA含量降低、SOD活性增強、ROS水平下降，說明依達拉奉可以減輕順鉑誘導的腎小管上皮細胞氧化應激反應；而給藥組腎小管上皮細胞凋亡減少，Bax 蛋白和mRNA表達下調，Bcl-2蛋白和 mRNA表達上調，Caspase-3活性減弱，證明依達拉奉通過下調促凋亡基因表達和上調抗凋亡基因表達，抑制Caspase-3活化，進而抑制順鉑誘導的腎小管上皮細胞凋亡。而國外研究也證實，通過抑制氧化應激，減少細胞凋亡，可以減輕順鉑造成的腎小管上皮細胞損傷[12-13]。

圖1 5組NRK-52E細胞凋亡率測定結果

圖2 5組NRK-52E細胞Bax與Bcl-2蛋白表達情況

Fig.2 Protein expression of Bax and Bcl-2 in five groups of NRK-52E cells

圖3 5組NRK-52E細胞Bax和Bcl-2 mRNA表達情況

Fig.3 mRNA expression of Bax and Bcl-2 in five groups of NRK-52E cells

本研究通過體外實驗結果表明，依達拉奉可通過抑制氧化應激和細胞凋亡，減輕順鉑誘導的大鼠腎小管上皮細胞。

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DOI 10.3870/yydb.2015.07.007

Protection of Edararone on Oxidative Stress and Apoptosis 40 Renal Tubular EpithelialCells in Rats

ZHANG Min1， SHEN Jianming2

(1.HubeiMedicalAssociation，Wuhan430071，China；2.DepartmentofNephrology，RenminHospital，HubeiUniversityofMedicine，Shiyan442000，China)

Objective To investigate the protective effect and its mechanism of edaravone against rat renal tubular epithelial cell injury induced by cisplatin. Methods The rat renal tubular epithelial cells (NRK-52E) were divided into the control， model control (50 μmol·mL-1cisplatin), group A (50 μmol·mL-1cisplatin plus 10 μmol·mL-1edaravone), B (50 μmol·mL-1cisplatin plus 20 μmol·mL-1edaravone), and C (50 μmol·mL-1cisplatin plus 40 μmol·mL-1edaravone).The cell proliferation ability, content of malondialdehyde, activity of superoxide dismutase(SOD), level of reactive oxygen species(ROS), rate of apoptosis, express of protein and mRNA of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 activation of cell were detected. Results The proliferation and SOD activity in NRK-52E cells declined, malondialdehyde and ROS were elevated upon being co-cultured with cisplatin.Moreover, the rate of apoptosis, express of protein and mRNA of Bax and Bcl-2, and Caspase-3 activation of cells were upregulated compared to the control group.However, edaravone stimulated cell proliferation, SOD activity and protein and mRNA of Bcl-2 and lowered content of malondialdehyde, level of ROS, rate of apoptosis, express of Bax protein and mRNA and Caspase-3 activation of cell(P<0.05). Conclusion Edaravone can alleviate rat renal tubular epithelial cell injury induced by cisplatin, via inhibiting oxidative stress and down-regulating cell apoptosis.

Edaravone；Cisplatin；Injury,renal；Oxidative stress；Apoptosis, cell

2014-09-19

2014-10-22

張敏(1976-)，女，湖北十堰人，副主任醫師，碩士，主要從事腫瘤疾病研究。E-mail：zhminhb@sina.com。

沈建明(1975-)，男，副主任醫師，碩士，主要從事腎臟病專業研究。E-mail：shmushjm@hotmail.com。

R692.5；R969

A

1004-0781(2015)07-0875-04