YC-1體外調控卵巢癌化學治療敏感性*

黃金玲，洪莉，洪莎莎，閔潔，胡鳴，趙楊，楊青

(武漢大學人民醫院婦產科，武漢 430060)

YC-1體外調控卵巢癌化學治療敏感性*

黃金玲，洪莉，洪莎莎，閔潔，胡鳴，趙楊，楊青

(武漢大學人民醫院婦產科，武漢 430060)

目的 探討缺氧誘導因子抑制劑YC-1對人卵巢癌細胞A2780s順鉑化療敏感性的影響。方法 將培養好的卵巢癌細胞分為對照組、YC-1組、順鉑組、YC-1+順鉑組，分別給予等量0.9%氯化鈉溶液、YC-1、順鉑、YC-1 +順鉑處理。Real time PCR檢測各組缺氧誘導因子HIF-1α和血管內皮生長因子(VEGF)mRNA相對表達量2-△△CT值；蛋白質印跡法檢測各組HIF-1α和VEGF灰度值反應蛋白表達量；比較各組間HIF-1α和VEGF表達水平差異，評價卵巢癌細胞微環境中缺氧程度及血管生成能力變化。結果 HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白在YC-1組、順鉑組、YC-1+順鉑組中的表達均顯著低于對照組(P<0.05)；YC-1+順鉑組HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白表達顯著低于順鉑組(P<0.05)；YC-1組與順鉑組比較，mRNA及蛋白表達差異無統計學意義；HIF-1α與VEGF mRNA在各組間的表達水平呈正相關(相關系數為0.830 5)。結論 YC-1具有抗卵巢癌作用，與順鉑聯合應用能夠增強其化學治療敏感性。

3-(5'-羥甲基-2'-呋喃基)-1-苯甲基吲唑；缺氧誘導因子；癌，卵巢；順鉑；耐藥

卵巢癌在女性生殖系統惡性腫瘤中發病率居第 2 位。因其發病隱匿、病情發展迅速，病死率居于婦科惡性腫瘤之首，5 年生存率25%～30%[1]。對于中、晚期卵巢癌患者，手術后化學治療(化療)是主要治療手段，因此耐藥與藥物不良反應是影響治療效果的重要因素。順鉑目前被廣泛用于多種惡性腫瘤化療，也是卵巢癌化療的臨床一線用藥，但耐藥問題普遍存在，嚴重影響化療效果，導致不良預后比例增加，因此尋找改善其耐藥狀況的有效手段是亟待解決的問題。

研究認為，惡性腫瘤中缺氧微環境的形成與腫瘤的惡性侵襲能力及耐藥性密切相關。缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是介導腫瘤缺氧適應并促進腫瘤生長的關鍵因子，同時在基因水平直接調控血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達，導致血管大量增生，進而導致腫瘤生長失控、耐藥性增加[2]。

3-(5′-羥甲基-2′-呋喃基)-1-苯甲基吲唑[1-benzyl-3- (5-hydroxymethylfur-2-yl) indazole ，YC-1]是一種人工合成物的HIF-1抑制藥，可從多方面抑制腫瘤生長，如細胞周期抑制、誘導細胞凋亡、抗腫瘤血管生成等，已有細胞及動物實驗等發現其在治療肝癌及宮頸癌等方面的價值[3]，筆者在本實驗中將YC-1與順鉑聯合作用于卵巢癌細胞A2780s，觀察其抗卵巢癌、增加順鉑化療敏感性的效果，以期為其臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人卵巢癌細胞株A2780s，購自中國典型培養物保藏中心。

1.2 藥品與試劑 Trizol Reagent(Invitrogen Life Technologies，目錄號：15596-026)；反轉錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，Thermo生產，目錄號：#K1622)；定量PCR試劑盒[FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)，Roche生產，目錄號：04 913914 001]；引物：由Invitrogen Biotechnology Co., LTD中國公司合成；兔抗人Actin(Santa公司)、兔抗人HIF-1α、兔抗人VEGF(Epitomics公司)，二抗山羊抗兔(KPL公司)；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇購自國藥集團化學試劑有限公司。YC-1(Enzo life sciences，批號：ALX-420-025-M001，含量：1 mg)

1.3 儀器與設備 離心機(Heal Force，型號：臺式高速冷凍離心機Neofuge 15R)；熒光定量PCR儀(SLAN熒光定量PCR檢測系統，上海宏石醫療科技有限公司生產)；超凈工作臺(蘇凈安泰，型號：SW-CJ-1FD)；離心管、TIP頭均購自Axygen Biosciences。

1.4 實驗步驟

1.4.1 細胞分組及處理 將細胞培養并傳代后制成1×107個·mL-1細胞懸液，臺盼藍染色示活細胞數>95%。將培養好的細胞隨機分為對照組、YC-1組、順鉑組、YC-1+順鉑組，每組3個樣本。對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液處理，YC-1組給予10 μmol·L-1YC-1，順鉑組給予10 μg·L-1順鉑，YC-1+順鉑組給予10 μmol·L-1YC-1 +10 μg·L-1順鉑。均孵育24 h。

1.4.2 Real time PCR 采用TriIzoL試劑提取總RNA。經反轉錄后按實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行操作定量PCR，引物由Invitrogen Biotechnology Co.，LTD中國公司合成，見表1，實驗重復3次。結果計算采用相對定量ΔΔCT法，即以內參基因actin 為標準，計算實驗樣本相對于校準樣本目標基因的變化倍數，CT值為初始循環數，即擴增產物累積增多至足以產生熒光信號時記錄下來的循環數，取3個樣本CT值的平均數，△CT=CT目的基因-CTβ-actin，△△CT=△CT實驗-△CT對照，擴增倍數=2-△△CT，代表mRNA的相對表達量。

1.4.3 蛋白質印跡法(Western blot) 藥物孵育后每組取106個細胞，提取蛋白質。經Bradford法定量，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離、轉膜、反應后分別加入兔抗人Actin、兔抗人HIF-1α、兔抗人VEGF，經孵育過夜、二抗山羊抗兔反應并顯影，實驗重復3次。以AlphaEase FC軟件掃描并分析圖象，計算灰度值。

表1 引物序列

2 結果

2.1 Real time PCR結果

2.1.1 HIF-1α及VEGF mRNA的表達 實驗結果顯示，與對照組比較，YC-1組、順鉑組及YC-1+順鉑組HIF-1α及VEGF mRNA表達均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；YC-1+順鉑組HIF-1α和VEGF mRNA表達明顯低于YC-1組和順鉑組，均差異有統計學意義(P<0.05)；YC-1組與順鉑組比較，HIF-1α及VEGF mRNA表達差異無統計學意義(圖1)。

與對照組比較，*1P<0.05；與YC-1+順鉑組比較，*2P<0.05

圖1 4組細胞HIF-1α與VEGF mRNA表達情況

Compared with control group ，*1P<0.05；compared with YC-1 plus cisplatin group，*2P<0.05

Fig.1 mRNA expression of HIF-1α and VEGF in four groups of cells

2.1.2 HIF-1α及VEGF mRNA表達相關性分析 經Pearson相關性分析，取95%可信區間，結果HIF-1α與VEGF mRNA 在各組的表達具有正相關性，r=0.830 5(圖2)。

圖2 HIF-1α與VEGF mRNA 相關性分析

Fig.2 Correlation analysis on mRNA expression of HIF-1α and VEGF

2.2 Western blot結果 在actin 蛋白表達基本一致的情況下，YC-1組、順鉑組及YC-1+順鉑組HIF-1α及VEGF蛋白表達低于對照組；YC-1+順鉑組HIF-1α和VEGF蛋白表達低于YC-1組和順鉑組(圖3)。通過AlphaEase FC軟件計算灰度值，HIF-1α/actin及VEGF/actin代表蛋白表達量，進行統計學分析，亦得到相似結果：YC-1組、順鉑組及YC-1+順鉑組HIF-1α與VEGF蛋白表達均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；YC-1+順鉑組HIF-1α與VEGF mRNA表達低于YC-1組和順鉑組，差異有統計學意義(P<0.05)；YC-1組與順鉑組比較，HIF-1α及VEGF蛋白表達差異無統計學意義(圖4)。

圖3 HIF-1α及VEGF 蛋白電泳結果

Fig.3 Protein electrophoresis of HIF-1α and VEGF

3 討論

卵巢癌化療耐藥是目前臨床導致卵巢癌死亡率高、預后差的重要因素之一，本研究從蛋白及mRNA水平證實YC-1降低卵巢癌細胞株A2780s中HIF-1α及血管生成因子VEGF的表達，改善了其中的缺氧狀態，抑制血管的生成，與順鉑聯合應用能夠增加卵巢癌細胞A2780s對順鉑化療的敏感性。

與對照組比較，*1P<0.05；與YC-1+順鉑組比較，*2P<0.05

圖4 HIF-1α及VEGF蛋白的表達灰度分析

Compared with control group，*1P<0.05；compared with YC-1 plus cisplatin group，*2P<0.05

Fig.4 Gradation analysis on the protein expression of HIF-1α and VEGF

研究證實，實體腫瘤中缺氧環境的形成是腫瘤生長失控、浸潤轉移、血管異常增生及腫瘤耐藥發生的關鍵微環境改變，其形成原因可能是因為其生長速度快，其中的新生血管生成相對緩慢，造成瘤體中部分缺氧區域，為了改善缺氧環境，腫瘤又進一步產生了一系列誘導新生血管生成的機制以保證供氧，造成腫瘤中大量異形血管生成，而這種典型的惡性侵襲行為又進一步增加了腫瘤的生存力和侵犯能力[4]。在這其中起到調節作用的HIF-1轉錄因子，在調節新生血管的生成中起到了關鍵作用。許多研究表明，HIF-1在實體腫瘤中高表達，對腫瘤的生長過程起正調節作用，意味著腫瘤的缺氧狀態，而缺氧又進一步使腫瘤細胞變得更加不穩定，增加腫瘤的侵襲力及對放化療的抵抗性[2]，因此近年來對HIF-1為靶點的研究逐漸增多。HIF-1包括α和β兩個亞基，目前發現HIF-α有3個亞型，分別為HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，其中HIF-1α是唯一的氧調節亞單位，決定HIF-1轉錄活性的關鍵蛋白，HIF-1α的表達程度隨細胞內氧濃度而變，缺氧狀態抑制了HIF-1α的降解，導致其在細胞內的濃度升高。并且HIF-1α因其氧相關表達的特異性，在腫瘤治療中有其獨特的優勢：在缺氧環境、癌基因激活或抑癌基因失活時會被激活并過量表達，在正常組織中通過蛋白酶體途徑被降解，表達量很低[5]。

近年對于HIF-1α抑制藥的研究較多，其中YC-1為人工合成的一種化合物，最初主要應用于血栓方面的研究，具有抑制血小板聚集、ATP釋放、磷酸肌醇分解的作用，并上調細胞內游離鈣離子，在臨床上具有防治血管內血栓形成的研究價值[3，6]。后來有研究發現其在肝癌細胞中能夠抑制HIF-1α及VEGF表達，抑制腫瘤的進展[7]，在動物實驗中也發現YC-1引起HIF-1α的下調，減少新生血管的生成[8]，抑制腫瘤的生長，而且并未發現YC-1引起嚴重的毒副作用或免疫抑制[9]，因此其作為抗腫瘤藥物在臨床應用的潛在可能前景較為樂觀。本實驗中已經證實卵巢癌細胞株A2780s在經過YC-1孵育之后其內的HIF-1α蛋白及mRNA的表達明顯低于對照組，證明在卵巢癌細胞中YC-1可有效改善腫瘤缺氧狀態，從而達到抑制腫瘤生長的作用。

另外本實驗中檢測癌細胞中VEGF的表達，VEGF蛋白及mRNA表達降低提示血管生成受到抑制。VEGF是最主要的血管生成因子，也是目前研究最為熱點的腫瘤血管生成及轉移相關的細胞因子之一。VEGF在正常細胞和腫瘤細胞中均可合成分泌，可以促進內皮細胞增殖、新生血管形成和增加血管通透性，實驗證實卵巢癌組織中HIF-1 mRNA表達與VEGF表達呈正相關，HIF-1通過誘導VEGF分泌的增加促進腫瘤新生血管形成[10]，本研究進一步證實YC-1能夠抑制A2780s卵巢癌細胞株中的血管生成。

本實驗中筆者通過體外培養卵巢癌細胞，從蛋白和mRNA水平分別檢測癌細胞中HIF-1α和VEGF的表達，結果顯示經YC-1孵育后的卵巢癌細胞HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表達量明顯低于對照組，而和順鉑組比較差異無統計學意義，相關性分析顯示兩組間正相關，已知HIF-1α與環境缺氧程度呈正相關，而VEGF反映腫瘤細胞中血管生成的能力，因此實驗結果提示YC-1能夠改善卵巢癌當中的缺氧狀況，抑制新生血管生成，有可能作為抗卵巢癌的藥物獨立使用。而YC-1+順鉑組中HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表達量明顯低于YC-1、順鉑單一用藥組，可見二者聯合應用增加了卵巢癌細胞A2780s對順鉑化療的敏感性，有效抑制腫瘤細胞生長。但是對于YC-1增加順鉑化療敏感性的機制目前尚未完全明確。考慮可能是缺氧環境改善后抑制了相關耐藥基因的表達[11]，或可能因改善了缺氧環境而抑制了多藥耐藥基因MDRI中的低氧反應原件，進而改善了腫瘤耐藥性[12]。CHI等[11]在2007年即通過細胞體外培養和動物實驗兩種途徑證實了YC-1下調肝癌中P-Stat3的表達，而后者是腫瘤化療耐藥的重要遞質，YC-1與順鉑聯合用藥可增強肝癌的化療敏感性，而對于卵巢癌目前為止尚無相關研究報道，本實驗部分填補了這方面的研究空白。

關于YC-1對腫瘤中血管生成的影響，已經證實其對乳腺癌中血管生成的抑制作用[13]，本實驗結果表明VEGF與 HIF-1α mRNA表達呈正相關，證明了卵巢癌細胞中的缺氧條件可使VEGF表達增強，從而影響組織中血管的生成及紅細胞能量代謝，卵巢癌細胞更好的適應缺氧狀態，而YC-1能夠抑制卵巢癌細胞中HIF-1α的表達，進而降低VEGF的表達，抑制血管生成，降低腫瘤的侵襲力。

本實驗結果表明，YC-1在體外實驗中可以有效改善卵巢癌細胞中的缺氧狀況，抑制新生血管的生成，提高卵巢癌細胞對順鉑化療的敏感性，為未來卵巢癌臨床藥物治療多樣化提供一定的實驗基礎。

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DOI 10.3870/yydb.2015.07.006

InvitroReguation of YC-1 on the Chemotherapy Sensitivity of Ovarian Cancer

HUANG Jinling，HONG Li，HONG Shasha，MIN Jie，HU Ming，ZHAO Yang，YANG Qing

(DepartmentofGynecologyandObstetrics，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060，China)

Objective To investigate the contribution of hypoxia-inducible factor inhibitor YC-1 to cisplatin chemo-sensitivity to human ovarian cancer cells A2780sinvitro. Methods Ovarian cancer cells were divided into four groups which were treated with saline, YC-1, cisplatin, and YC-1 + cisplatin, separately, mRNA of HIF-1α and VEGF in the A2780s cells were detected by real-time fluorescence quantitative PCR by calculating 2-△△CT；the protein were detected by Western blot, to evaluate the change of hypoxia and angiogenesis capabilities under the ovarian cancer microenvironment. Results Compared with the control group, mRNA and protein of HIF-1α and VEGF expressed less in the group of YC-1, cisplatin and YC-1+cisplatin；while, those in the group of YC-1 + cisplatin were lower than the monotherapy (P<0.05), but no significant difference was detected between the YC-1 and cisplatin groups, and the expression of HIF-1 α and VEGF mRNA were positively related(r=0.830 5)in each group. Conclusion YC-1 exerts the antitumor effect and may contribute to sensitivity to cisplatin in the therapy of ovarian cancer.

1-Benzyl-3-(5-hydroxymethylfur-2-yl)indazole；Hypoxia-inducible factor；Cancer, ovarian；Cisplatin；Chemo-resistance

2014-06-25

2014-07-22

*湖北省自然科學基金資助項目(2010CDB06903)

黃金玲(1983-)，女，吉林吉林人，主治醫師，在讀博士，研究方向：婦科腫瘤。電話：027-88041911-82128，E-mail：sherryjinling@foxmail.com。

洪莉(1970-)，女，湖北武漢人，主任醫師，博士，研究方向：婦科腫瘤和盆底功能障礙性疾病。E-mail：drhongli1011@yeah.net。

R737.31；R965

A

1004-0781(2015)07-0871-05